يجب أن يستخدم تفاعل سموم شقائق النعمان البحرية أقل عدد من الكائنات الحية والبروتوكولات الفعالة للحصول على تنوع كبير ووفرة من السموم والتحديد السريع لسموم معينة. لقد جمعنا بين تقنيتين فعالتين لإعداد المستخلص الخام بكمية عالية من البروتين ووصف الفحوصات القابلة للتكرار والمحددة والسريعة وغير المكلفة لتحديد انحلال الدم والقواعد الفوسفولية في سم شقائق النعمان البحرية. يمكن استخدام هذه الطريقة في أي مثال تقريبا يتم تحديده لتحديد أحد أو كلا النوعين من السيتوليزين.
يتم تحقيق كفاءة الطريقة من خلال العناية بالأوقات في كل خطوة أثناء إعداد المستخلص الخام. مفتاح انحلال الدم هو التعامل الدقيق مع كريات الدم الحمراء لتجنب التحلل الميكانيكي ، وفي فحص انحلال الفوسفو ، مع العناية بدرجة الحرارة في إعداد اللوحة. سيوضح الإجراء الدكتور سانتوس راميريز كاريتو ، وعالمة الأحياء ساندرا سالازار غارسيا ، وعالم الأحياء جيوفاني ماسياس مارتينيز من مختبري.
ابدأ بتنظيف شقائق النعمان البحرية التي تم جمعها A.doi بالماء المقطر يدويا لإزالة جزيئات الركيزة الكبيرة الملتصقة بالجسم. قم بتجميد الكائنات الحية على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في الفريزر الفائق لمدة 72 ساعة. ثم ، ضع الكائنات الحية في أكواب خاصة لتجفيف التجميد مع ظروف التجفيد لمدة 48 ساعة.
لترطيب الأنسجة ، أعد تشكيل 20 جراما من الوزن الجاف للكائنات الحية المجففة بالتجميد مع 60 ملليلتر من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم 50 مللي مولا وقرص كوكتيل مثبط واحد. في التحريك المغناطيسي ، حرك العينة باستمرار عند حوالي 800 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة. بعد تجميد العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 12 ساعة للحث على تحلل الخلايا وتصريف الكيس الخيطي ، ضع الحاوية في الماء في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب بنسبة تصل إلى 90٪ كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
لتوضيح المستخلص ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 25،400 مرة من G لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استعادة supernatant وطرد مركزي مرة أخرى. كرر الخطوة ثلاث إلى أربع مرات واسترد الخارق أخيرا.
يحتوي المستخلص الفائق أو الخام المستعاد على مكونات السم وجزيئات الخلايا الأخرى مثل الدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية. تحديد تركيز البروتين من المستخلص الخام باستخدام مجموعة فحص الألوان التجارية برادفورد. احتضن العينات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز.
ثم قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر. ارسم متوسطات امتصاص BSA للعينة وأوجد معادلة الرسم البياني حيث y هو الامتصاص ، m هو ميل الخط ، x هو تركيز البروتين ، و b هو الإحداثي للأصل. لتحليل المستخلص الخام ، أضف 30 ميكروغرام من المستخلص الخام إلى خمسة ميكرولترات من مخزن تحميل البروتين المخزن المؤقت لتشويه البروتينات.
يجب أن يكون الحجم النهائي أقل من 50 ميكرولتر. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 25 مللي أمبير ثابت لمدة ساعة واحدة و 30 دقيقة. لتجنب انتشار بروتينات الجل ، أضف محلول التثبيت إلى البروتينات واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة.
ثم ، صب المحلول وأضف محلول ربط البروتين. حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز في 80 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المحلول واغسل الجل ب 100 ملليلتر من الماء المقطر لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، قم بإزالة الماء وكرر هذا الإجراء أربع مرات. قم بإجراء تلطيخ البروتين باستخدام 50 ملليلتر من محلول Coomassie Brilliant Blue R-250 المصفى مع التحريك عند 60 دورة في الدقيقة في مذبذب دوار مختبري في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. استخراج ملليلتر واحد من الدم من الوريد الوداجي للأغنام وإزالة الإبرة من المحقنة.
قم بتصريف الدم على الفور في أنبوب يحتوي على 50 ملليلتر من محلول Alsever وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 804 مرات G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت وأضف 30 ملليلتر من محلول Alsever عن طريق تحريكه على طول الجدران الداخلية للأنبوب. أعد تعليق الكريات ببطء باستخدام ماصة بلاستيكية باستور وقم بالطرد المركزي للمحلول مرة أخرى بسرعة 804 مرات G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
كرر هذا الإجراء حتى يتم توضيح supernatant. الحفاظ على الحجم النهائي لمحلول Alsever لتحقيق تركيز 2 مليون خلية لكل ملليلتر تقريبا. ثم استخدم غرفة نيوباور أو مقياس الدم لحساب الخلايا.
احتضن مخاليط المحلول لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز ثم قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 804 مرات G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. استرجع السوبرناتانت في طبق آخر من 96 بئرا بقاع مسطح. إذا كان المستخلص الخام يحتوي على السيتوليسين ، فإن كريات الدم الحمراء سوف تتحلل وتطلق الهيموغلوبين.
اقرأ الامتصاص عند 415 نانومتر واحسب كمية المستخلص الذي ينتج انحلال الدم في 50٪ من كريات الدم الحمراء. زيادة كمية مستخلص شقائق النعمان البحرية الخام وتصميم المؤامرة مع التعديلات السينية باستخدام البرامج المناسبة. اغسل بيضة دجاج واحدة مع 1٪ SDS في الماء المقطر وافصل صفار البيض عن بياض البيض في ظل ظروف معقمة.
تحضير المحاليل A و B و C و D.أضف 500 ميكرولتر من المحاليل A و C إلى المحلول B و 100 ميكرولتر من المحلول D.اخلطها واسكب 25 ملليلتر في كل طبق بتري. انتظر حتى يتصلب المحلول في ظل ظروف معقمة وجعل الآبار التي يبلغ قطرها حوالي 2 إلى 3 ملليمترات بأنبوب رفيع. أضف ما مجموعه 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفوسفات كعنصر تحكم سلبي في بئر واحد و 20 ميكرولتر من الفوسفوليباز المحدد كعنصر تحكم إيجابي في بئر آخر.
ضع كميات مختلفة من بروتين المستخلص الخام 5 و 15 و 25 و 35 و 45 ميكروغرام في الآبار المتبقية ، كل منها في حجم نهائي من 20 ميكرولتر. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. وأظهرت النتائج التمثيلية للبروتوكول المستخدم للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية أن الجمع بين تقنيتين، هما الإثارة ودورات التجميد والذوبان، أدى إلى تصريف فعال للأكياس الخيطية.
تظهر الخلايا الخيطية قبل وبعد المحفزات هنا. يتم الكشف عن نبيب الكيس الخيطي في هذه الصورة ، مما يشير إلى إطلاق السموم. يظهر هنا الملف الكهربائي لمستخلص خام شقائق النعمان البحرية.
تم تحليل مستخلص شقائق النعمان البحرية الخام بواسطة SDS-PAGE 15٪ من هلام البولي أكريلاميد وأظهر البروتين من 10 كيلودالتون إلى 250 كيلودالتون من الوزن الجزيئي. هنا ، الممر 1 هو سلم البروتين والممر 2 هو سم شقائق النعمان البحرية. تم الكشف عن Cytolysins في منطقة الوزن الجزيئي من 15 كيلودالتون و 20 كيلودالون.
يظهر هنا فحص انحلال الدم في كريات الدم الحمراء من الأغنام. زاد النشاط الانحلالي للمستخلص قبل وأثناء دورات التجميد والذوبان حتى تم الوصول إلى انحلال الدم بنسبة 100٪ مع 50 ميكروغرام من إجمالي بروتين المستخلص الخام في الدورتين الأخيرتين. الكمية اللازمة لتحلل 50٪ من كريات الدم الحمراء للأغنام هي 11.1 0.3 ميكروغرام لكل ملليلتر.
تم الكشف عن نشاط الفوسفوليباز عن طريق تكوين هالات واضحة في مناطق صفيحة الأجار حيث تم تطبيق عينة المستخلص الخام. أظهرت النتائج وجود نشاط فوسفوليباز من 15 ميكروغرام من البروتين الكلي. زاد قطر الهالة بطريقة تعتمد على الجرعة ؛ أي إذا زادت كمية المستخلص الخام ، زاد قطر الهالة.
أثناء محاولة الإجراء ، تأكد من تحفيز إفراز الكيس الخيطي ، وتحديد كمية البروتين الكلي ، وتحليل المستخلص الخام بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، وحساب كمية بروتين المستخلص الخام لإنتاج 50٪ من انحلال الدم ، واستخدام كميات مختلفة من البروتين في فحص الفوسفوليباز. يمكننا تحليل المستخلص الخام بواسطة تقنية البروتينات لتحديد الببتيدات المتعددة ذات الأهمية الكبيرة في التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي ، حتى تحديد ملامح وتوصيف جزيء فريد ثم إنتاجه في المختبر للتطبيق. حصلنا على جزء من تسلسل البروتين المؤدي مع نشاط مضاد للورم في الخلايا الظهارية لسرطان الرئة البشري العنيد.
وبالمثل ، نحدد تسلسل الفوسفوليباز ذي الأهمية التكنولوجية الحيوية.
