イソギンチャク毒素相互作用は、毒素の多様性と豊富さ、および特定の毒素の迅速な同定を得るために、最小限の数の生物と効率的なプロトコルを使用しなければなりません。我々は、2つの効率的な技術を組み合わせて、大量のタンパク質を含む粗抽出物を調製し、イソギンチャク毒中の溶血およびホスホリック塩基を同定するための再現性、特異的、高速、および安価なアッセイを記述した。この方法は、一方または両方のタイプのサイトライシンを同定することに決定されたほとんどすべての例において使用することができる。
この方法の効率は、粗抽出物を調製しながら各ステップの時間の世話をすることによって達成される。溶血の鍵は、機械的溶解を避けるために赤血球を慎重に取り扱い、リン分解アッセイでは、プレートの調製における温度の世話をすることである。この手順を実演するのは、私の研究室のサントス・ラミレス・カレート博士、生物学者のサンドラ・サラザール・ガルシア、生物学者のジョバンニ・マシアス・マルティネスです。
まず、回収したイソギンチャクA.doiを蒸留水で手で洗浄し、本体に付着した大きな基質粒子を除去します。直ちに超冷凍庫でマイナス80°Cで72時間生物を凍結する。その後、生物を特別なガラスに入れ、凍結乾燥条件下で48時間凍結乾燥する。
組織水和のために、60ミリリットルの50ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液および1つの阻害剤カクテル錠剤を用いて、凍結乾燥生物の乾燥重量20グラムを再構成する。マグネチックスターラーで、サンプルを約800 RPMと摂氏4度で12時間連続して攪拌します。試料をマイナス20°Cで12時間凍結して細胞溶解および線虫嚢胞排出を誘導した後、容器を室温の水に入れ、90%まで融解するまでこの手順を3回繰り返す。
抽出物を清澄にするために、サンプルを摂氏4度で40分間、25、400回Gで遠心分離する。上清を回収し、再度遠心分離する。この手順を3~4回繰り返し、ようやく上澄み液を回収します。
回収された上清または粗抽出物は、毒成分および脂質、炭水化物および核酸などの他の細胞分子を含有する。市販のブラッドフォード比色アッセイキットを用いて粗抽出物のタンパク質濃度を決定する。試料を振とうせずに室温で5分間インキュベートする。
その後、595ナノメートルにおける吸光度を測定する。サンプルBSA吸光度の平均をプロットし、yが吸光度、mが線の傾き、xがタンパク質濃度、bが原点の縦軸であるグラフの式を決定します。粗抽出物を分析するには、5マイクロリットルのタンパク質担持バッファーに30マイクログラムの粗抽出物を加え、タンパク質を変性させる。
最終容量は50マイクロリットル未満でなければなりません。電気泳動を25ミリアンペアの定数で1時間30分間実行します。ゲルタンパク質の拡散を避けるために、固定溶液をタンパク質に加え、室温で80RPMで振とうしながら40分間インキュベートする。
次いで、溶液をデカントし、タンパク質架橋溶液を加える。80RPMで振とうしながら室温で30分間インキュベートする。溶液を取り出し、ゲルを100ミリリットルの蒸留水で5分間洗浄する。
その後、水を取り除き、この手順を4回繰り返します。50ミリリットルのクーマシーブリリアントブルーR-250ろ過溶液を実験室の回転式発振器で室温で15分間60RPMで攪拌してタンパク質染色を行う。羊の頸静脈から1ミリリットルの血液を抽出し、注射器から針を取り出す。
直ちに50ミリリットルのアルセバー溶液を含むチューブに血液を排出し、摂氏4度で5分間、804倍Gで遠心分離する。上清を捨て、チューブの内壁に沿ってスライドさせて30ミリリットルのアルセバー溶液を加えます。パスツールプラスチックピペットを使用してペレットをゆっくりと再懸濁し、溶液を摂氏4度で5分間、804倍Gで再度遠心分離する。
上清が透明になるまでこの手順を繰り返します。アルセバー溶液の最終体積を維持して、1ミリリットルあたり約200万セルの濃度を達成する。次に、ノイバウアーチャンバーまたは血球計数器を使用して細胞を計数します。
溶液混合物を振盪せずに摂氏37度で1時間インキュベートし、次いでプレートを摂氏4度で5分間804倍Gで遠心分離する。上清を平底の別の96ウェルプレートに回収する。粗抽出物にサイトライシンが含まれている場合、赤血球はヘモグロビンを溶解して放出します。
415ナノメートルでの吸光度を読み取り、赤血球の50%で溶血を生じる抽出物の量を計算する。イソギンチャク粗抽出物の量を増やし、適切なソフトウェアを使用してシグモイド調整でプロットを設計します。1%SDSで鶏卵1個を蒸留水で洗浄し、無菌状態で卵黄を卵白から分離します。
溶液A、B、C、およびDを調製し、溶液Bに500マイクロリットルの溶液AおよびCを加え、溶液Dを100マイクロリットル加える。溶液が無菌条件下で固化するのを待って、細い管で直径約2〜3ミリメートルのウェルを作る。1つのウェルに陰性対照として合計20マイクロリットルのリン酸緩衝液を加え、別のウェルに陽性対照として決定されたホスホリパーゼ20マイクロリットルを加える。
異なる量の粗抽出タンパク質5、15、25、35、および45マイクログラムを残りのウェルに入れ、それぞれ最終容量20マイクロリットルに入れる。摂氏37度で20時間インキュベートする。イソギンチャクの粗抽出物を得るために使用されたプロトコールの代表的な結果は、2つの技術、攪拌および凍結および融解のサイクルを組み合わせることで、線虫嚢胞の効率的な排出を生じることを示した。
刺激前後の線虫細胞をここに示す。線虫嚢胞尿細管はこの画像に露出しており、毒素放出を示す。イソギンチャク粗抽出物の電気泳動プロファイルをここに示す。
イソギンチャク粗抽出物をSDS-PAGE 15%ポリアクリルアミドゲルで分析し、分子量10キロダルトンから250キロダルトンまでのタンパク質を示した。ここで、レーン1はタンパク質はしごであり、レーン2はイソギンチャク毒である。サイトライシンは、15キロダルトンおよび20キロダルトンの分子量ゾーンで検出された。
ここに示されているのは、ヒツジ由来の赤血球における溶血アッセイである。凍結および融解サイクルの前および中の抽出物の溶血活性は、最後の2サイクルで全粗抽出物タンパク質の50マイクログラムで100%溶血に達するまで増加した。50%の羊赤血球を溶解するのに必要な量は、1ミリリットルあたり11.1 0.3マイクログラムです。
ホスホリパーゼ活性は、粗抽出試料が施用された寒天プレートの領域における透明なハローの形成によって検出された。結果は、15マイクログラムの総タンパク質からのホスホリパーゼ活性の存在を示す。ハローの直径は用量依存的に増加した;すなわち、粗抽出物の量が増加すると、ハローの直径は増加した。
手順を試みている間、線虫嚢胞の排出を誘導し、全タンパク質を定量し、SDS-PAGE電気泳動によって粗抽出物を分析し、溶血の50%を生成する粗抽出タンパク質の量を計算し、ホスホリパーゼアッセイで異なる量のタンパク質を使用する。粗抽出物をプロテオミクス技術によって分析して、バイオテクノロジーやバイオメディシンに大きな関連性を持つポリペプチドを同定し、ユニークな分子をプロファイルして特徴付け、実験室で製造して応用することができます。本発明者らは、ヒト閉膜肺癌上皮細胞において抗腫瘍活性を有するタンパク質の配列の一部を得た。
同様に、我々はバイオテクノロジーが興味を持っているホスホリパーゼの配列を同定する。
