Die Interaktion mit Seeanemonentoxin muss die geringste Anzahl von Organismen und effiziente Protokolle verwenden, um eine große Vielfalt und Fülle der Toxine und eine schnelle Identifizierung eines bestimmten Toxins zu erhalten. Wir kombinierten zwei effiziente Techniken, um den Rohextrakt mit einer hohen Menge an Protein herzustellen und reproduzierbare, spezifische, schnelle und kostengünstige Assays zu beschreiben, um Hämolyse und phospholische Basen im Seeanemonengift zu identifizieren. Die Methode kann in fast jedem Beispiel verwendet werden, das entschieden wird, um eine oder beide Arten von Cytolysinen zu identifizieren.
Die Effizienz der Methode wird erreicht, indem bei der Zubereitung des Rohextrakts auf die Zeiten in jedem Schritt geachtet wird. Der Schlüssel zur Hämolyse ist die sorgfältige Handhabung des Erythrozyten, um eine mechanische Lyse zu vermeiden, und bei der Phospholyseuntersuchung die Pflege der Temperatur bei der Vorbereitung der Platte. Das Verfahren wird von Dr. Santos Ramirez-Carreto, der Biologin Sandra Salazar Garcia und dem Biologen Giovanni Macias Martinez aus meinem Labor demonstriert.
Beginnen Sie mit der Reinigung der gesammelten Seeanemone A.doi mit destilliertem Wasser von Hand, um die großen Substratpartikel zu entfernen, die am Körper haften. Sofort die Organismen bei minus 80 Grad Celsius in einem Ultrafreezer für 72 Stunden einfrieren. Dann legen Sie die Organismen in spezielle Gläser zur Gefriertrocknung unter Lyophilisationsbedingungen für 48 Stunden.
Für die Gewebehydratation rekonstituieren Sie 20 Gramm Trockengewicht lyophilisierter Organismen mit 60 Millilitern 50-Millimolar-Natriumphosphatpuffer und einer Inhibitor-Cocktailtablette. Rühren Sie die Probe in einem Magnetrührer 12 Stunden lang kontinuierlich bei etwa 800 U / min und vier Grad Celsius um. Nachdem Sie die Probe 12 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius eingefroren haben, um Zelllyse und Nematokzystenausfluss zu induzieren, stellen Sie den Behälter bei Raumtemperatur in Wasser, bis er bis zu 90% auftautWiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
Um den Extrakt zu klären, zentrifugieren Sie die Probe bei 25, 400 mal G für 40 Minuten bei vier Grad Celsius. Gewinnen Sie den Überstand zurück und zentrifugieren Sie ihn erneut. Wiederholen Sie den Schritt drei- bis viermal und stellen Sie den Überstand schließlich wieder her.
Der gewonnene Überstand oder Rohextrakt enthält die Giftbestandteile und andere Zellmoleküle wie Lipide, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Rohextrakts mit einem handelsüblichen kolorimetrischen Assay-Kit von Bradford. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ohne zu schütteln.
Messen Sie dann die Absorption bei 595 Nanometern. Zeichnen Sie die Mittelwerte der BSA-Absorptionen der Probe auf und bestimmen Sie die Gleichung des Diagramms, wobei y die Absorption, m die Steigung der Linie, x die Proteinkonzentration und b die Ordinate des Ursprungs ist. Um den Rohextrakt zu analysieren, fügen Sie 30 Mikrogramm des Rohextrakts zu fünf Mikrolitern des Proteinladepuffers hinzu, um die Proteine zu denaturieren.
Das endgültige Volumen muss weniger als 50 Mikroliter betragen. Führen Sie die Elektrophorese mit einer Konstante von 25 Milliampere für eine Stunde und 30 Minuten durch. Um die Diffusion der Gelproteine zu vermeiden, fügen Sie die Fixationslösung zu den Proteinen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 40 Minuten mit Schütteln bei 80 U / min.
Dekantieren Sie dann die Lösung und fügen Sie die Proteinvernetzungslösung hinzu. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 80 U / min. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie das Gel mit 100 Millilitern destilliertem Wasser für fünf Minuten.
Danach entfernen Sie das Wasser und wiederholen Sie diesen Vorgang viermal. Führen Sie die Proteinfärbung mit 50 Millilitern Coomassie Brilliant Blue R-250 gefilterter Lösung durch, die bei 60 U / min in einem Labor-Rotationsoszillator bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt wird. Extrahieren Sie einen Milliliter Blut aus der Halsvene eines Schafes und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze.
Blut sofort in ein Röhrchen mit 50 Millilitern Alver-Lösung ablassen und bei 804 mal G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 30 Milliliter Alver-Lösung hinzu, indem Sie ihn entlang der Innenwände des Schlauches schieben. Suspendieren Sie das Pellet langsam mit einer Pasteur-Kunststoffpipette und zentrifugieren Sie die Lösung erneut bei 804 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Überstand geklärt ist. Halten Sie das Endvolumen der Alver-Lösung aufrecht, um eine Konzentration von etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Verwenden Sie dann eine Neubauer-Kammer oder ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.
Inkubieren Sie die Lösungsgemische für eine Stunde bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln und zentrifugieren Sie dann die Platte bei 804 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Stellen Sie den Überstand in einer weiteren 96-Well-Platte mit einem flachen Boden wieder her. Wenn der Rohextrakt Cytolysine enthält, werden Erythrozyten lysieren und Hämoglobin freisetzen.
Lesen Sie die Absorption bei 415 Nanometern und berechnen Sie die Menge an Extrakt, die Hämolyse in 50% der Erythrozyten produziert. Erhöhen Sie die Menge an Meeranemonen-Rohölextrakt und entwerfen Sie das Diagramm mit sigmoidalen Anpassungen mit entsprechender Software. Waschen Sie ein Hühnerei mit 1% SDS in destilliertem Wasser und trennen Sie das Eigelb unter sterilen Bedingungen vom Eiweiß.
Bereiten Sie die Lösungen A, B, C und D vor.Fügen Sie 500 Mikroliter Lösungen A und C zu Lösung B und 100 Mikroliter Lösung D hinzu.Mischen Sie sie und gießen Sie 25 Milliliter in jede Petrischale. Warten Sie, bis die Lösung unter sterilen Bedingungen erstarrt ist, und machen Sie mit einem dünnen Rohr Vertiefungen von etwa zwei bis drei Millimetern Durchmesser. Insgesamt 20 Mikroliter Phosphatpuffer als Negativkontrolle in eine Vertiefung und 20 Mikroliter einer bestimmten Phospholipase als Positivkontrolle in eine andere Vertiefung geben.
Geben Sie verschiedene Mengen des Rohextraktproteins 5, 15, 25, 35 und 45 Mikrogramm in die verbleibenden Vertiefungen, jeweils in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern. 20 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die repräsentativen Ergebnisse des Protokolls, das zur Gewinnung des Rohölextrakts aus Seeanemone verwendet wurde, zeigten, dass die Kombination von zwei Techniken, Bewegung und Zyklen des Einfrierens und Auftauens, zu einer effizienten Entladung von Nematozysten führte.
Die Nematozyten vor und nach Reizen sind hier dargestellt. Der Nematozystentubuli ist in diesem Bild belichtet, was auf die Toxinfreisetzung hinweist. Das elektrophoretische Profil von Meeranemone-Rohextrakt ist hier dargestellt.
Der Meeranemonen-Rohölextrakt wurde mit SDS-PAGE 15% Polyacrylamid-Gel analysiert und zeigte Protein von 10 Kilodalton bis 250 Kilodalton Molekulargewicht. Hier ist Spur 1 die Proteinleiter und Bahn 2 ist Seeanemonengift. Cytolysine wurden in der Molekulargewichtszone von 15 Kilodalton und 20 Kilodalton nachgewiesen.
Hier ist der Hämolyse-Assay in Erythrozyten von Schafen gezeigt. Die hämolytische Aktivität des Extrakts vor und während der Gefrier- und Auftauzyklen nahm zu, bis in den letzten beiden Zyklen eine Hämolyse von 100% mit 50 Mikrogramm des gesamten Rohextraktproteins erreicht wurde. Die Menge, die benötigt wird, um 50% Schaferythrozyten zu lysieren, beträgt 11,1 0,3 Mikrogramm pro Milliliter.
Die Phospholipase-Aktivität wurde durch die Bildung klarer Halos in den Bereichen der Agarplatte nachgewiesen, in denen die Rohextraktprobe aufgetragen wurde. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Phospholipase-Aktivität aus 15 Mikrogramm Gesamtprotein. Der Durchmesser des Halos nahm dosisabhängig zu, das heißt, wenn die Menge an Rohextrakt zunahm, nahm der Durchmesser des Halos zu.
Stellen Sie beim Ausprobieren des Verfahrens sicher, dass Sie Nematozystenentladung induzieren, das Gesamtprotein quantifizieren, Rohextrakt durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysieren, die Menge an Rohextraktprotein berechnen, um 50% der Hämolyse zu produzieren, und verwenden Sie verschiedene Mengen an Protein im Phospholipase-Assay. Wir können den Rohextrakt mittels Proteomtechnik analysieren, um Polypeptide mit großer Relevanz in der Biotechnologie und Biomedizin zu identifizieren, sogar ein einzigartiges Molekül zu profilieren und zu charakterisieren und es dann im Labor für eine Anwendung herzustellen. Wir erhielten einen Teil der Sequenz eines ausführenden Proteins mit Antitumoraktivität in den menschlichen hartnäckigen Lungenkarzinom-Epithelzellen.
Ebenso identifizieren wir die Sequenz von Phospholipasen von biotechnologischem Interesse.
