L'interazione della tossina anemone di mare deve utilizzare il minor numero di organismi e protocolli efficienti per ottenere una grande diversità e abbondanza delle tossine e una rapida identificazione di una tossina specifica. Abbiamo combinato due tecniche efficienti per preparare l'estratto grezzo con un'elevata quantità di proteine e descrivere saggi riproducibili, specifici, veloci e poco costosi per identificare l'emolisi e le basi fostoliche nel veleno di anemone di mare. Il metodo può essere utilizzato in quasi tutti gli esempi che si decide di identificare uno o entrambi i tipi di citolisine.
L'efficienza del metodo si ottiene curando i tempi in ogni fase durante la preparazione dell'estratto grezzo. La chiave per l'emolisi è un'attenta manipolazione dell'eritrocita per evitare la lisi meccanica e, nel test di fosfolisi, prendendosi cura della temperatura nella preparazione della piastra. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Santos Ramirez-Carreto, la biologa Sandra Salazar Garcia e il biologo Giovanni Macias Martinez del mio laboratorio.
Inizia pulendo l'anemone di mare raccolto A.doi con acqua distillata a mano per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo. Congelare immediatamente gli organismi a meno 80 gradi Celsius in un ultragelatore per 72 ore. Quindi, posizionare gli organismi in bicchieri speciali per la liofilizzazione con condizioni di liofilizzazione per 48 ore.
Per l'idratazione dei tessuti, ricostituire 20 grammi di peso secco di organismi liofilizzati con 60 millilitri di tampone fosfato di sodio 50 millimolare e una compressa di cocktail inibitore. In un agitatore magnetico, mescolare continuamente il campione a circa 800 RPM e quattro gradi Celsius per 12 ore. Dopo aver congelato il campione a meno 20 gradi Celsius per 12 ore per indurre la lisi cellulare e lo scarico di nematocisti, posizionare il contenitore in acqua a temperatura ambiente fino a quando non si scongela fino al 90%Ripetere questa procedura tre volte.
Per chiarire l'estratto, centrifugare il campione a 25, 400 volte G per 40 minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante e centrifugarlo di nuovo. Ripeti il passaggio tre o quattro volte e recupera finalmente il surnatante.
Il surnatante recuperato o estratto grezzo contiene i componenti del veleno e altre molecole cellulari come lipidi, carboidrati e acidi nucleici. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit di analisi colorimetrica Bradford commerciale. Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente senza agitare.
Quindi, misurare l'assorbanza a 595 nanometri. Traccia le medie delle assorbanze BSA del campione e determina l'equazione del grafico dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'ordinata all'origine. Per analizzare l'estratto grezzo, aggiungere 30 microgrammi di estratto grezzo a cinque microlitri del tampone di carico proteico per denaturare le proteine.
Il volume finale deve essere inferiore a 50 microlitri. Eseguire l'elettroforesi a 25 milliampere costanti per un'ora e 30 minuti. Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione alle proteine e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti con agitazione a 80 RPM.
Quindi, decantare la soluzione e aggiungere la soluzione di reticolazione proteica. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione a 80 RPM. Rimuovere la soluzione e lavare il gel con 100 millilitri di acqua distillata per cinque minuti.
Successivamente, rimuovere l'acqua e ripetere questa procedura quattro volte. Effettuare la colorazione proteica con 50 millilitri di soluzione filtrata Coomassie Brilliant Blue R-250 mescolando a 60 RPM in un oscillatore rotativo da laboratorio a temperatura ambiente per 15 minuti. Estrarre un millilitro di sangue dalla vena giugulare di una pecora e rimuovere l'ago dalla siringa.
Scaricare immediatamente il sangue in un tubo con 50 millilitri di soluzione di Alsever e centrifugare a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e aggiungere 30 millilitri di soluzione Alsever facendolo scorrere lungo le pareti interne del tubo. Risospese lentamente il pellet utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e centrifugare nuovamente la soluzione a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Ripetere questa procedura fino a quando il surnatante non è chiarito. Mantenere il volume finale della soluzione Alsever per raggiungere una concentrazione di circa 2 milioni di cellule per millilitro. Quindi, utilizzare una camera Neubauer o un emocitometro per contare le cellule.
Incubare le miscele di soluzioni per un'ora a 37 gradi Celsius senza agitare e quindi centrifugare la piastra a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Se l'estratto grezzo contiene citolisine, gli eritrociti lisi e rilasciano emoglobina.
Leggi l'assorbanza a 415 nanometri e calcola la quantità di estratto che produce l'emolisi nel 50% degli eritrociti. Aumentare la quantità di estratto grezzo di anemone di mare e progettare la trama con regolazioni sigmoidali utilizzando un software appropriato. Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata e separare il tuorlo d'uovo dall'albume in condizioni sterili.
Preparare le soluzioni A, B, C e D.Aggiungere 500 microlitri di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 microlitri di soluzione D.Mescolarli e versare 25 millilitri in ogni capsula di Petri. Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili e realizzare pozzetti di circa due o tre millimetri di diametro con un tubo sottile. Aggiungere un totale di 20 microlitri di tampone fosfato come controllo negativo in un pozzetto e 20 microlitri di una determinata fosfolipasi come controllo positivo in un altro pozzo.
Posizionare diverse quantità di proteine dell'estratto grezzo 5, 15, 25, 35 e 45 microgrammi nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 ore. I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno dimostrato che la combinazione di due tecniche, agitazione e cicli di congelamento e scongelamento, ha prodotto uno scarico efficiente di nematocisti.
I nematociti prima e dopo gli stimoli sono mostrati qui. Il tubulo di nematocisti è esposto in questa immagine, indicando il rilascio di tossine. Il profilo elettroforetico dell'estratto grezzo di anemone di mare è mostrato qui.
L'estratto grezzo di anemone di mare è stato analizzato da SDS-PAGE 15% poliacrilammide gel e ha mostrato proteine da 10 kilodalton a 250 kilodalton di peso molecolare. Qui, la corsia 1 è la scala proteica e la corsia 2 è il veleno di anemoni di mare. Le citolisine sono state rilevate nella zona di peso molecolare di 15 kilodalton e 20 kilodalton.
Qui è mostrato il test di emolisi negli eritrociti delle pecore. L'attività emolitica dell'estratto prima e durante i cicli di congelamento e scongelamento è aumentata fino a raggiungere l'emolisi al 100% con 50 microgrammi della proteina totale dell'estratto grezzo negli ultimi due cicli. La quantità necessaria per lisare il 50% degli eritrociti di pecora è di 11,1 0,3 microgrammi per millilitro.
L'attività della fosfolipasi è stata rilevata dalla formazione di aloni chiari nelle aree della piastra di agar in cui è stato applicato il campione di estratto grezzo. I risultati mostrano la presenza di attività fosfolipasi da 15 microgrammi di proteine totali. Il diametro dell'alone è aumentato in modo dose-dipendente;cioè, se la quantità di estratto grezzo è aumentata, il diametro dell'alone è aumentato.
Durante il tentativo di procedura, assicurarsi di indurre lo scarico di nematocisti, quantificare la proteina totale, analizzare l'estratto grezzo mediante elettroforesi SDS-PAGE, calcolare la quantità di proteine dell'estratto grezzo per produrre il 50% di emolisi e utilizzare diverse quantità di proteine nel saggio della fosfolipasi. Possiamo analizzare l'estratto grezzo con tecnica proteomica per identificare polipeptidi di grande rilevanza in biotecnologia e biomedicina, anche profilare e caratterizzare una molecola unica per poi produrla in laboratorio per un'applicazione. Abbiamo ottenuto parte della sequenza di una proteina performante con attività antitumorale nelle cellule epiteliali del carcinoma polmonare ostinato umano.
Allo stesso modo, identifichiamo la sequenza di fosfolipasi di interesse biotecnologico.
