A interação com a toxina de anêmona do mar deve usar o menor número de organismos e protocolos eficientes para obter grande diversidade e abundância das toxinas e identificação rápida de uma toxina específica. Combinamos duas técnicas eficientes para preparar o extrato bruto com uma alta quantidade de proteína e descrever ensaios reprodutíveis, específicos, rápidos e baratos para identificar bases hemólise e fosfólicas no veneno de anêmona marinha. O método pode ser usado em quase qualquer exemplo que se desprendou para identificar um ou ambos os tipos de citolysinas.
A eficiência do método é alcançada cuidando dos tempos em cada etapa durante a preparação do extrato bruto. A chave para a hemólise é o manuseio cuidadoso do eritrócito para evitar a lise mecânica, e no ensaio de fosfólise, cuidando da temperatura na preparação da placa. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Santos Ramirez-Carreto, a bióloga Sandra Salazar Garcia e o biólogo Giovanni Macias Martinez do meu laboratório.
Comece limpando a anêmona do mar coletada A.doi com água destilada à mão para remover as grandes partículas de substrato que aderiram ao corpo. Congele imediatamente os organismos a menos 80 graus Celsius em um ultracongelante por 72 horas. Em seguida, coloque os organismos em copos especiais para congelar a secagem com condições de liofilização por 48 horas.
Para hidratação tecidual, reconstitua 20 gramas de peso seco de organismos liofilizados com 60 mililitros de tampão fosfato de sódio de 50 milimolares e um comprimido de coquetel inibidor. Em um agitador magnético, mexa continuamente a amostra em torno de 800 RPM e quatro graus Celsius por 12 horas. Depois de congelar a amostra a menos 20 graus Celsius por 12 horas para induzir a lise celular e a descarga do nematócito, coloque o recipiente na água em temperatura ambiente até descongelar até 90% Repita este procedimento três vezes.
Para esclarecer o extrato, centrifufique a amostra a 25.400 vezes G durante 40 minutos a quatro graus Celsius. Recupere o supernatante e centrifuá-lo novamente. Repita o passo de três a quatro vezes e recupere o supernatante finalmente.
O extrato supernante ou bruto recuperado contém os componentes do veneno e outras moléculas celulares, como lipídios, carboidratos e ácidos nucleicos. Determine a concentração proteica do extrato bruto usando um kit comercial de ensaio colorimétrico bradford. Incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente sem tremer.
Em seguida, meça a absorvância em 595 nanômetros. Plote as médias das absorvâncias BSA da amostra e determine a equação do gráfico onde y é a absorção, m é a inclinação da linha, x é a concentração de proteína, e b é a ordinaada à origem. Para analisar o extrato bruto, adicione 30 microgramas do extrato bruto a cinco microliters do tampão de carga de proteínas para desnaturar as proteínas.
O volume final deve ser inferior a 50 microliters. Executar eletroforese a 25 miliamperes constante por uma hora e 30 minutos. Para evitar a difusão das proteínas em gel, adicione a solução de fixação às proteínas e incubar à temperatura ambiente por 40 minutos com agitação a 80 RPM.
Em seguida, decante a solução e adicione a solução de crosslinking de proteínas. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação a 80 RPM. Retire a solução e lave o gel com 100 mililitros de água destilada por cinco minutos.
Depois disso, retire a água e repita este procedimento quatro vezes. Realize a coloração proteica com 50 mililitros de solução filtrada Coomassie Brilliant Blue R-250 mexendo a 60 RPM em um oscilador rotativo de laboratório à temperatura ambiente por 15 minutos. Extrair um mililitro de sangue da veia jugular de uma ovelha e remover a agulha da seringa.
Drene imediatamente o sangue em um tubo com 50 mililitros de solução Alsever e centrífuga a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e adicione 30 mililitros de solução Alsever deslizando-o ao longo das paredes internas do tubo. Leve lentamente a pelota usando uma pipeta de plástico Pasteur e centrifugar a solução novamente a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Repita este procedimento até que o sobrenatante seja esclarecido. Mantenha o volume final da solução Alsever para alcançar uma concentração de 2 milhões de células por mililitro aproximadamente. Em seguida, use uma câmara de Neubauer ou hemótmetro para contar as células.
Incubar as misturas da solução por uma hora a 37 graus Celsius sem tremer e, em seguida, centrifugar a placa a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Recupere o supernatante em outra placa de 96 poços com um fundo plano. Se o extrato bruto contiver citolises, os eritrócitos irão lise e liberarão hemoglobina.
Leia a absorvência em 415 nanômetros e calcule a quantidade de extrato que produz hemólise em 50% dos eritrócitos. Aumente a quantidade de extrato bruto de anêmona do mar e projete o lote com ajustes sigmoidal usando software apropriado. Lave um ovo de galinha com 1%de SDS em água destilada e separe a gema de ovo da clara de ovo em condições estéreis.
Prepare as soluções A, B, C e D.Add 500 microliters de soluções A e C para a solução B e 100 microliters de solução D.Mix-los e despeje 25 mililitros em cada placa de Petri. Aguarde a solução para solidificar em condições estéreis e fazer poços de aproximadamente dois a três milímetros de diâmetro com um tubo fino. Adicione um total de 20 microlitres de tampão fosfato como um controle negativo em um poço e 20 microlitres de uma fosfolipase determinada como um controle positivo em outro poço.
Coloque diferentes quantidades da proteína extrato bruto 5, 15, 25, 35 e 45 microgramas nos poços restantes, cada um em um volume final de 20 microliters. Incubar a 37 graus Celsius por 20 horas. Os resultados representativos do protocolo utilizado para a obtenção do extrato bruto da anêmona do mar mostraram que a combinação de duas técnicas, agitação e ciclos de congelamento e descongelamento, produziu uma descarga eficiente de nematocistos.
Os nematocitos antes e depois dos estímulos são mostrados aqui. O túbulo do nematocisto é exposto nesta imagem, indicando a liberação da toxina. O perfil eletroforético do extrato bruto de anêmona marinha é mostrado aqui.
O extrato bruto de anêmona marinha foi analisado pelo gel de poliacrilamida de 15%da SDS-PAGE e mostrou proteína de 10 kilodaltons a 250 kilodaltons de peso molecular. Aqui, a pista 1 é a escada de proteína e a pista 2 é veneno de anêmona marinha. Citolysinas foram detectadas na zona de peso molecular de 15 kilodaltons e 20 kilodaltons.
Mostrado aqui é o ensaio de hemólise em eritrócitos de ovelhas. A atividade hemolítica do extrato antes e durante os ciclos de congelamento e descongelamento aumentou até que 100% da hemólise foi atingida com 50 microgramas da proteína total do extrato bruto nos dois últimos ciclos. A quantidade necessária para lise 50% de eritrócitos de ovelhas é de 11,1 0,3 microgramas por mililitro.
A atividade de fosfolipase foi detectada pela formação de halos claros nas áreas da placa de ágar onde a amostra de extrato bruto foi aplicada. Os resultados mostram a presença de atividade fosfolipase a partir de 15 microgramas de proteína total. O diâmetro do halo aumentou de forma dependente de dose;ou seja, se a quantidade de extrato bruto aumentou, o diâmetro do halo aumentou.
Ao tentar o procedimento, certifique-se de induzir a descarga do nematocisto, quantificar a proteína total, analisar extrato bruto pela eletroforese SDS-PAGE, calcular a quantidade de proteína extrato bruta para produzir 50% da hemólise e usar diferentes quantidades de proteína no ensaio fosfolipase. Podemos analisar o extrato bruto por técnica proteômica para identificar polipeptídeos com grande relevância em biotecnologia e biomedicina, até mesmo perfilar e caracterizar uma molécula única e depois produzi-la em laboratório para uma aplicação. Obtivemos parte da sequência de uma proteína performática com atividade antitumoral nas células epiteliais de carcinoma pulmonar obstinada humanas.
Da mesma forma, identificamos a sequência de fosfolipases de interesse biotecnológico.
