نحن نجمع بين التشريح المجهري لالتقاط الليزر مع بروتوكول بحث الحمض النووي الريبي أحادي الخلية يسمى CEL-Seq2 لإنشاء مجموعات بيانات نسخية لعينات الأنسجة الفردية الصغيرة. تتيح لنا هذه التقنية دراسة التعبير الجيني في الأنسجة أو الأنواع التي لا يمكن دراستها باستخدام طرق فرز الخلايا التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر خصوصية أكثر من نهج الحمض النووي الريبي السائب.
هنا أظهرنا هذه التقنية لأطراف الذيل الأربعة الخلوية لذكور المرحلة اليرقية الرابعة C.elegans والخنثى. لكن جمال هذا النهج هو أنه يمكن تطبيقه حتى على الأنواع غير النموذجية. ستوضح الإجراء السيدة ريا جلاد ، طالبة الدكتوراه من مختبري والدكتور أنطونيو هيريرا ، كبير علماء الطب الحيوي حاليا في مدرسة بايلور في تشاتانوغا ، تينيسي.
ابدأ بسحب واحد إلى ملليلترين من المخزن المؤقت M9 برفق على جدار اللوحة دون الرش. قم بتدوير اللوحة لإزاحة الديدان. قم بإزالة والتخلص من كل السائل والديدان عن طريق وضع طرف الماصة على جدار اللوحة على حافة الأجار لتجنب ثقب الثقوب.
يظهر هذا الفيديو اللوحة قبل إزالة الأمهات واليرقات. يجب ترك الأجنة فقط بعد إزالة الأمهات واليرقات. ستبدأ يرقة L1 في الظهور بعد الحضانة لمدة ساعة أو نحو ذلك.
ثم ضع اللوحة عند 25 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. قم بإسقاط ملليلتر واحد من المخزن المؤقت M9 بعناية على الأجار وقم بتدوير اللوحة لإزاحة L1s ولكن ليس الأجنة.
الطرد المركزي للأنبوب وماصة L1s مباشرة على العشب البكتيري للوحة البذور. حافظ على الديدان عند 25 درجة مئوية. تحت مجهر التشريح عند تكبير 30 إلى 50 X ، ابدأ في اختيار الذكور والخنثى من لوحات التزامن إلى لوحات منفصلة غير جالسة.
تتميز الذكور عن الخنثى بالشكل المنتفخ واللون الفاتح لذيول الذكور مقارنة بالشكل المدبب واللون الداكن لذيول الخنثى. اغسل الديدان من الطبق باستخدام ملليلتر إلى ملليلتر من المخزن المؤقت M9 باستخدام طرف ماصة مغسول مسبقا بمخزن مؤقت M9 يحتوي على منظف بنسبة 0.01٪. انقل الديدان إلى أنبوب طرد مركزي واحد ملليلتر ، وتدور لمدة دقيقة واحدة وتضيف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت M9.
مرة أخرى ، تدور لمدة دقيقة واحدة. أضف ملليلتر واحد من الثلج البارد 70٪ من الميثانول واخلطه جيدا. كرر الغسيل مع واحد ملليلتر من الميثانول ، واخلطه جيدا.
قم بتدويره لمدة دقيقة واحدة وأضف 500 ميكرولتر من 70٪ ميثانول. امزجه وخزنه عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة بين عشية وضحاها. ماصة 20 ميكرولتر من الديدان الثابتة على الجانب المطلي من البولي إيثيلين النفثالات أو الزجاج غشاء PEN.
انتظر حتى يتبخر الميثانول. قم بإزالة الدرع البلاستيكي فوق المسرح وانقر فوق زر التفريغ مع السهم لأعلى لتحميل شرائح الغشاء. تأكد من أن الشريحة جافة تماما ، واقلبها بحيث يكون الغشاء متجها لأسفل وأدخل الشريحة.
انقر فوق متابعة في نافذة تغيير العينة. سيتحرك حامل الشريحة. ثم استبدل الدرع البلاستيكي ، في أسفل الشاشة ، واختر حامل الشريحة الذي يحتوي على الشريحة وانقر فوق زر التفريغ بالسهم لأسفل لتحميل الأنابيب.
اسحب الدرج للخارج وأزل كتلة الأنبوب. أدخل أغطية الأنبوب المكونة من أربعة أنابيب PCR سعة 500 ميكرولتر في الحامل وقم بطي الأنبوب تحتها. أعد الكتلة إلى الدرج وحرك الدرج مرة أخرى إلى مرحلة المجهر.
في النافذة المنبثقة لجهاز تجميع التغييرات، حدد أنابيب PCR، وانقر فوق موافق. انقر على موقع الأنبوب الفارغ في أسفل يسار الشاشة أسفل أغطية أنبوب جهاز التجميع وفي لوحة التحكم في المجهر حدد TLBF لإضاءة المجال الساطع للضوء المرسل. باستخدام عدسة 2.5X ، اضبط التركيز البؤري حتى تظهر الديدان والبنية السطحية لغشاء PEN.
قم بالتبديل إلى عدسة 20X وانقل المرحلة إلى منطقة خالية من الديدان. اضبط التركيز بحيث يكون للهياكل الشبيهة بالفقاعة في الغشاء لون مصفر لتركيز الليزر على المستوى البؤري الصحيح ثم قم بتعيين معلمات الليزر. للحصول على نصائح الذيل ، ابدأ بفتحة Power 45 30 في السرعة 20.
في لوحة تحكم الليزر، حدد المعايرة واتبع التعليمات. بعد ذلك ، في الجزء السفلي من الشاشة في أغطية أنبوب جهاز المجمع ، انقر فوق الموضع A ، على الجانب الأيمن من الشاشة حدد شكلا واحدا ، متبوعا بالرسم والقطع. ثم حدد نقطة إلى نقطة وارسم خطا.
انقر فوق بدء القطع بحيث يقطع الليزر الغشاء. ابحث عن دودة وقم بالتبديل للتحرك والقطع. استخدم الماوس لقطع الذيل.
لجمع العينة، قم بالتبديل إلى إعداد الرسم والقطع باستخدام وظيفة النقطة إلى النقطة وشكل الرسم لإكمال قطع مقطع الغشاء. حدد الأنبوب التالي في غطاء أنبوب جهاز التجميع في الجزء السفلي من الشاشة واقطع طرف الذيل التالي. بمجرد قطع أربعة ذيول ، قم بتفريغ رف الأنبوب بالنقر فوق التفريغ باستخدام السهم لأسفل.
ابحث عن أقسام الغشاء تحت مجهر تشريح واستمر في معالجة العينات النهائية. هنا تسلسل الحمض النووي الريبي مع CEL-Seq2. ماصة 1.2 ميكرولتر من مزيج رئيسي من التمهيدي CEL-Seq2 مباشرة فوق العينة وإغلاق الأنبوب.
ضع الملصق بالرقم التمهيدي وضع غطاء الأنبوب على الفور مباشرة على قطعة من الثلج الجاف لتجميد العينة وبالتالي منع تدهور الحمض النووي الريبي. كرر ذلك حتى يتم جمع جميع العينات. أخيرا ، قم بتخزين الأنابيب عند درجة حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر.
يمكن تمييز C.elegans L3 خنثى وذكور في 21 إلى 23 ساعة بعد الفقس تحت مجهر تشريح من خلال مورفولوجيا ذيولهم. حكاية الخنثى ضيقة في حين أن حكاية الذكور منتفخة وتبدو واضحة. يظهر مظهر هيكل شريحة غشاء القلم وذيل الدودة في هذه الصور.
هنا التركيز صحيح لعدسات 20X و 40X في المجهر. الذيل التشريحي المقطوع بشكل محايد من غشاء القلم مرئي هنا. بعد إغلاق الفجوة في القطع ، ستسقط قطعة الغشاء في غطاء الأنبوب أسفل الشريحة.
يظهر هنا غطاء أنبوب مع قسم غشاء PEN يحتوي على طرف ذيل مشوه. تمثل الصورة الرسومية السجل الطبيعي المحول المعرف الجزيئي الفريد أو عدد UMI لكل طرف ذيل فردي لنقاط زمنية وجنسين مختلفين. يستخدم برنامج powsimR لتحديد عدد العينات المستقلة المطلوبة للكشف عن الجينات المعبر عنها أو DE التفاضلية على مستويات التعبير المختلفة.
تمثل الصورة الرسومية هنا المعدل الإيجابي الحقيقي للكشف عن جينات DE بين شرطين لأربع عمليات محاكاة مختلفة تتضمن أحجام عينات مختلفة لكل حالة. يشير الخط المتقطع إلى معدل إيجابي حقيقي بنسبة 80٪. يظهر معدل الاكتشاف الخاطئ ونفس عمليات المحاكاة الأربعة هنا.
يشير الخط المتقطع إلى معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 10٪. أظهرت الرسوم البيانية أن حجم العينة البالغ 70 طرف ذيل لكل حالة يكفي للكشف عن جينات DE باستثناء الجينات ذات مستويات التعبير المنخفضة للغاية. من أجل المزامنة المناسبة ، تأكد من وجود الأجنة فقط على اللوحة.
لضمان عدم فقدان العينة، قم بماصة مزيج التمهيدي مباشرة على قسم غشاء القلم في الغطاء وكن لطيفا للغاية في إغلاق الغطاء. نظرا لأنه نوع لاأدري ، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف كيفية تطور الشبكات التنظيمية الجينية للهياكل المتجانسة في الأنواع المختلفة.
