Wir kombinieren Laser-Capture-Mikrodissektion mit einem einzelligen RNA-Seek-Protokoll namens CEL-Seq2, um transkriptomische Datensätze für kleine einzelne Gewebeproben zu generieren. Diese Technik ermöglicht es uns, die Genexpression in Geweben oder Spezies zu untersuchen, die mit herkömmlichen Zellsortiermethoden nicht untersucht werden können. Darüber hinaus bietet es mehr Spezifität als ein Bulk-RNA-Seq-Ansatz.
Hier demonstrierten wir diese Technik für die vierzelligen Schwanzspitzen von C.elegans Männchen im vierten Larvenstadium und Hermaphroditen. Aber das Schöne an diesem Ansatz ist, dass er sogar auf Nicht-Modellarten angewendet werden kann. Das Verfahren wird Frau Raya Jallad, Doktorandin aus meinem Labor, und Dr. Antonio Herrera, derzeit leitender biomedizinischer Wissenschaftler an der Baylor-Schule in Chattanooga, Tennessee, demonstrieren.
Beginnen Sie damit, ein bis zwei Milliliter M9-Puffer vorsichtig gegen die Wand der Platte zu pipettieren, ohne zu spritzen. Schwenken Sie die Platte, um die Würmer zu entfernen. Entfernen und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit und die Würmer, indem Sie die Pipettenspitze an der Wand der Platte am Rand des Agars platzieren, um zu vermeiden, dass Löcher stechen.
Dieses Video zeigt die Platte, bevor Mütter und Larven entfernt werden. Nur Embryonen sollten übrig bleiben, nachdem die Mütter und Larven entfernt wurden. L1-Larve wird nach der Inkubation für eine Stunde oder so erscheinen.
Legen Sie dann die Platte auf 25 Grad Celsius. Entfernen Sie nach einer Stunde die Platte aus dem Inkubator. Lassen Sie vorsichtig einen Milliliter M9-Puffer auf das Agar fallen und schwenken Sie die Platte, um die L1s, aber nicht die Embryonen zu entfernen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen und pipettieren Sie die L1s direkt auf den Bakterienrasen einer ausgesäten Platte. Halten Sie die Würmer bei 25 Grad Celsius. Beginnen Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit einer Vergrößerung von 30 bis 50 x mit dem Pflücken der Männchen und der Hermaphroditen von den Synchronisationsplatten auf separaten unsitzenden Platten.
Männchen unterscheiden sich von Hermaphroditen durch die vorgewölbte Form und hellere Farbe der männlichen Schwänze im Vergleich zu der spitzen Form und dunkleren Farbe der Hermaphroditenschwänze. Waschen Sie die Würmer mit ein bis zwei Millilitern M9-Puffer von der Platte mit einer Pipettenspitze, die mit einem M9-Puffer vorgewaschen wurde, der 0,01% Reinigungsmittel enthält. Übertragen Sie die Würmer in ein Ein-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, drehen Sie es für eine Minute und fügen Sie einen Milliliter M9-Puffer hinzu.
Drehen Sie sich erneut für eine Minute. Fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 70% Methanol hinzu und mischen Sie gut. Wiederholen Sie die Wäsche mit einem Milliliter Methanol, mischen Sie gut.
Drehen Sie es für eine Minute und fügen Sie 500 Mikroliter 70% Methanol hinzu. Mischen Sie es und lagern Sie es bei vier Grad Celsius für eine Stunde bis über Nacht. Pipette 20 Mikroliter der festen Würmer auf die beschichtete Seite eines Polyethylen-Naphthalat- oder PEN-Membran-Glasobjektträgers.
Warten Sie, bis das Methanol verdampft ist. Entfernen Sie die Kunststoffabschirmung über der Bühne und klicken Sie auf die Entladetaste mit dem Aufwärtspfeil, um die Membranschienen zu laden. Stellen Sie sicher, dass der Objektträger vollständig trocken ist, drehen Sie ihn so um, dass die Membran nach unten zeigt, und setzen Sie den Objektträger ein.
Klicken Sie im Fenster zum Ändern der Probe auf Weiter. Der Diahalter bewegt sich. Ersetzen Sie dann die Kunststoffabschirmung, wählen Sie am unteren Bildschirmrand aus, welcher Diahalter die Folie enthält, und klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen mit dem Pfeil nach unten, um die Rohre zu laden.
Ziehen Sie das Fach heraus und entfernen Sie den Rohrblock. Setzen Sie die Tubenkappen von vier 500 Mikroliter PCR-Röhrchen in den Halter ein und falten Sie das Röhrchen darunter. Bringen Sie den Block in das Fach zurück und schieben Sie das Fach zurück in den Mikroskoptisch.
Wählen Sie im Popup-Fenster des Change Collector Device die Option PCR-Röhren aus und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Position der leeren Röhre unten links auf dem Bildschirm unter den Tubuskappen des Kollektorgeräts und wählen Sie im Bedienfeld des Mikroskops TLBF für die Hellfeldbeleuchtung des Durchlichts. Stellen Sie mit dem 2,5-fachen Objektiv den Fokus so lange ein, bis die Würmer und die Oberflächenstruktur der PEN-Membran sichtbar sind.
Wechseln Sie zum 20X-Objektiv und verschieben Sie die Bühne in einen Bereich ohne Würmer. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die blasenartigen Strukturen in der Membran eine gelbliche Farbe haben, um den Laser auf die richtige Fokusebene zu fokussieren, und stellen Sie dann die Laserparameter ein. Für die Heckspitzen beginnen Sie mit Power 45 Blende 30 in Geschwindigkeit 20.
Wählen Sie im Laserbedienfeld Kalibrieren und folgen Sie den Anweisungen. Als nächstes klicken Sie am unteren Bildschirmrand bei den Röhrenkappen des Kollektorgeräts auf Position A, wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms eine einzelne Form aus, gefolgt von Zeichnen und Schneiden. Wählen Sie dann Punkt zu Punkt und zeichnen Sie eine Linie.
Klicken Sie auf Startschnitt, damit der Laser die Membran durchschneidet. Suchen Sie einen Wurm und wechseln Sie, um sich zu bewegen und zu schneiden. Verwenden Sie die Maus, um den Schwanz zu durchschneiden.
Um die Probe zu sammeln, wechseln Sie zur Zeichen- und Schnitteinstellung mit der Punkt-zu-Punkt-Funktion und der Zeichnungsform, um den Schnitt eines Membranabschnitts abzuschließen. Wählen Sie die nächste Röhre an der Röhrenkappe des Kollektorgeräts am unteren Bildschirmrand aus und schneiden Sie die nächste Schwanzspitze ab. Sobald vier Schwänze geschnitten sind, entladen Sie das Rohrgestell, indem Sie mit dem Pfeil nach unten auf Entladen klicken.
Suchen Sie die Membranabschnitte unter einem Seziermikroskop und fahren Sie mit der nachgeschalteten Probenverarbeitung fort. Hier RNA-Sequenzierung mit CEL-Seq2. Pipettieren Sie 1,2 Mikroliter eines CEL-Seq2 Primer Mastermixes direkt auf die Probe und schließen Sie das Röhrchen.
Beschriften Sie mit der Primernummer und legen Sie die Tubenkappe sofort direkt auf ein Stück Trockeneis, um die Probe schockgefrieren zu lassen und so den RNA-Abbau zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gesammelt wurden. Zum Schluss lagern Sie die Röhren bei minus 70 Grad Celsius.
C.elegans L3 Hermaphroditen und Männchen 21 bis 23 Stunden nach dem Schlüpfen können unter einem Seziermikroskop durch die Morphologie ihrer Schwänze unterschieden werden. Die Geschichte von Hermaphroditen ist eng, während die von Männchen geschwollen ist und klar erscheint. Das Aussehen der PEN-Membran-Objektträgerstruktur und des Schneckenschwanzes ist in diesen Bildern dargestellt.
Hier ist der Fokus für die 20X und 40X Linsen am Mikroskop richtig. Die sezierte Schwanz, die die PEN-Membran unparteiisch ausgeschnitten hat, sind hier sichtbar. Nach dem Schließen der Lücke im Schnitt fällt das Membranstück in die Rohrkappe unterhalb des Objektträgers.
Hier ist eine Schlauchkappe mit einem PEN-Membranabschnitt mit einer sezierten Schwanzspitze zu sehen. Das grafische Bild stellt den natürlichen log transformierten eindeutigen molekularen Identifikator oder UMI-Zählungen pro individueller Schwanzspitze für verschiedene Zeitpunkte und Geschlechter dar. Die powsimR-Software wird verwendet, um zu bestimmen, wie viele unabhängige Proben benötigt werden, um differentielle exprimierte oder DE-Gene auf verschiedenen Expressionsebenen nachzuweisen.
Das grafische Bild hier stellt die wahre positive Rate dar, um die DE-Gene zwischen zwei Bedingungen für vier verschiedene Simulationen mit unterschiedlichen Stichprobengrößen pro Bedingung zu erkennen. Die gestrichelte Linie zeigt eine positive Rate von 80% an. Die False-Discovery-Rate und die gleichen vier Simulationen werden hier gezeigt.
Die gestrichelte Linie zeigt eine False-Discovery-Rate von 10 % an. Die Grafiken zeigten, dass eine Stichprobengröße von 70 Schwanzspitzen pro Bedingung ausreicht, um die DE-Gene mit Ausnahme der Gene mit sehr niedrigen Expressionswerten nachzuweisen. Stellen Sie für eine ordnungsgemäße Synchronisation sicher, dass nur Embryonen auf dem Teller vorhanden sind.
Um einen Probenverlust zu vermeiden, pipettieren Sie die Primermischung direkt auf die PEN-Membransektion in der Kappe und seien Sie äußerst schonend beim Schließen der Kappe. Da es speziesunabhängig ist, können wir dieses Protokoll verwenden, um zu untersuchen, wie sich genregulatorische Netzwerke für homologe Strukturen in verschiedenen Spezies entwickelt haben.
