Combinamos la microdisección de captura láser con un protocolo de búsqueda de ARN de una sola célula llamado CEL-Seq2 para generar conjuntos de datos transcriptómicos para pequeñas muestras de tejido individuales. Esta técnica nos permite estudiar la expresión génica en tejidos o especies que no pueden ser estudiadas utilizando métodos tradicionales de clasificación celular. Además, proporciona más especificidad que un enfoque de ARN-seq a granel.
Aquí demostramos esta técnica para las cuatro puntas de la cola celular de los machos y hermafroditas de cuarta etapa larval de C.elegans. Pero la belleza de este enfoque es que incluso se puede aplicar a especies no modelo. Raya Jallad, estudiante de doctorado de mi laboratorio y el Dr. Antonio Herrera, actualmente científico biomédico principal en la escuela Baylor en Chattanooga, Tennessee.
Comience por pipetear suavemente uno o dos mililitros de amortiguador M9 contra la pared de la placa sin chorrear. Gire la placa para desalojar los gusanos. Retire y deseche todo el líquido y los gusanos colocando la punta de la pipeta contra la pared de la placa en el borde del agar para evitar agujeros.
Este video muestra la placa antes de que las madres y las larvas sean eliminadas. Solo deben quedar embriones después de que se eliminen las madres y la larva. La larva L1 comenzará a aparecer después de la incubación durante una hora más o menos.
Luego coloque la placa a 25 grados centígrados. Después de una hora, retire la placa de la incubadora. Deje caer cuidadosamente un mililitro de tampón M9 sobre el agar y gire la placa para desalojar los L1 pero no los embriones.
Centrifugar el tubo y pipetear los L1 directamente sobre el césped bacteriano de una placa sembrada. Mantenga los gusanos a 25 grados centígrados. Bajo un microscopio de disección a un aumento de 30 a 50 X, comience a recoger los machos y los hermafroditas de las placas de sincronización en placas separadas no sembradas.
Los machos se distinguen de los hermafroditas por la forma abultada y el color más claro de las colas masculinas en comparación con la forma puntiaguda y el color más oscuro de las colas hermafroditas. Lave los gusanos de la placa con uno o dos mililitros de tampón M9 usando una punta de pipeta prelavada con tampón M9 que contenga detergente al 0.01%. Transfiera los gusanos a un tubo centrífugo de un mililitro, gire durante un minuto y agregue un mililitro de tampón M9.
De nuevo, gira durante un minuto. Añadir un mililitro de metanol helado al 70% y mezclar bien. Repita el lavado con un mililitro de metanol, mezcle bien.
Girarlo durante un minuto y añadir 500 microlitros de 70% de metanol. Mézclelo y guárdelo a cuatro grados centígrados durante una hora o toda la noche. Pipete 20 microlitros de los gusanos fijos en el lado recubierto de un naftalato de polietileno o un portaobjetos de vidrio con membrana PEN.
Espere a que el metanol se evapore. Retire el escudo de plástico sobre el escenario y haga clic en el botón de descarga con la flecha hacia arriba para cargar las correderas de membrana. Asegúrese de que la diapositiva esté completamente seca, voltee para que la membrana esté hacia abajo e inserte la diapositiva.
Haga clic en continuar en la ventana de cambio de muestra. El soporte de la diapositiva se moverá. Luego reemplace el escudo de plástico, en la parte inferior de la pantalla, elija qué soporte deslizante contiene la diapositiva y haga clic en el botón de descarga con la flecha hacia abajo para cargar los tubos.
Saque la bandeja y retire el bloque de tubo. Inserte las tapas de los tubos de cuatro tubos de PCR de 500 microlitros en el soporte y doble el tubo debajo. Devuelva el bloque a la bandeja y deslice la bandeja de nuevo en la etapa del microscopio.
En la ventana emergente cambiar dispositivo colector, seleccione Tubos pcr y haga clic en Aceptar. Haga clic en la ubicación vacía del tubo en la parte inferior izquierda de la pantalla debajo de las tapas del tubo del dispositivo colector y en el panel de control del microscopio seleccione TLBF para la iluminación de campo brillante de luz transmitida. Usando la lente 2.5X, ajuste el enfoque hasta que los gusanos y la estructura superficial de la membrana PEN sean visibles.
Cambie a la lente 20X y mueva el escenario a una región sin gusanos. Ajuste el enfoque de tal manera que las estructuras similares a burbujas en la membrana tengan un color amarillento para enfocar el láser en el plano focal correcto y luego establecer los parámetros del láser. Para las puntas de la cola, comience con la potencia 45 apertura 30 en velocidad 20.
En el panel de control láser, seleccione calibrar y siga las instrucciones. A continuación, en la parte inferior de la pantalla en las tapas del tubo del dispositivo colector, haga clic en la posición A, en el lado derecho de la pantalla seleccione una sola forma, seguida de dibujar y cortar. A continuación, seleccione punto a punto y dibuje una línea.
Haga clic en iniciar corte para que el láser corte a través de la membrana. Encuentra un gusano y cambia para moverte y cortar. Use el mouse para cortar la cola.
Para recoger la muestra, cambie a la configuración de dibujo y corte con la función punto a punto y dibuje la forma para completar el corte de una sección de membrana. Seleccione el siguiente tubo en la tapa del tubo del dispositivo colector en la parte inferior de la pantalla y corte la siguiente punta de la cola. Una vez que se corten cuatro colas, descargue el bastidor del tubo haciendo clic en descargar con la flecha hacia abajo.
Encuentre las secciones de membrana bajo un microscopio de disección y continúe con el procesamiento de muestras aguas abajo. Aquí secuenciación de ARN con CEL-Seq2. Pipete 1.2 microlitros de una mezcla maestra de imprimación CEL-Seq2 directamente sobre la muestra y cierre el tubo.
Etiquete con el número de imprimación e inmediatamente coloque la tapa del tubo directamente sobre un trozo de hielo seco para congelar la muestra y evitar la degradación del ARN. Repetir hasta que se hayan recogido todas las muestras. Finalmente, guarde los tubos a menos 70 grados centígrados.
Los hermafroditas de C.elegans L3 y los machos a las 21 a 23 horas después de la eclosión se pueden distinguir bajo un microscopio de disección por la morfología de sus colas. La historia de hermafrodita es estrecha, mientras que la de los machos está hinchada y parece clara. La apariencia de la estructura de deslizamiento de membrana PEN y la cola de gusano se muestra en estas imágenes.
Aquí el enfoque es correcto para las lentes 20X y 40X en el microscopio. La cola diseccionada cortada imparcialmente la membrana PEN son visibles aquí. Después de cerrar el espacio en el corte, la pieza de membrana caerá en la tapa del tubo debajo de la diapositiva.
Aquí se muestra una tapa de tubo con una sección de membrana PEN que contiene una punta de cola diseccionada. La imagen gráfica representa el identificador molecular único transformado en logarítmico natural o recuentos de UMI por punta de cola individual para diferentes puntos de tiempo y sexos. El software powsimR se utiliza para determinar cuántas muestras independientes se requieren para detectar genes diferenciales expresados o DE en varios niveles de expresión.
La imagen gráfica aquí representa la verdadera tasa positiva para detectar los genes DE entre dos condiciones para cuatro simulaciones diferentes que incorporan diferentes tamaños de muestra por condición. La línea discontinua indica una tasa positiva real del 80%. La tasa de descubrimiento falso y las mismas cuatro simulaciones se muestran aquí.
La línea discontinua indica una tasa de descubrimiento falso del 10%. Los gráficos mostraron que un tamaño de muestra de 70 puntas de cola por condición es suficiente para detectar los genes DE, excepto los genes con niveles de expresión muy bajos. Para una sincronización adecuada, asegúrese de que solo los embriones estén presentes en la placa.
Para evitar la pérdida de muestra, pipetee la mezcla de imprimación directamente sobre la sección de membrana PEN en la tapa y sea extremadamente suave al cerrar la tapa. Debido a que es agnóstico de la especie, podemos usar este protocolo para explorar cómo las redes reguladoras de genes han evolucionado para estructuras homólogas en diferentes especies.
