우리는 레이저 캡처 미세 해부와 CEL-Seq2라는 단일 세포 RNA 탐색 프로토콜을 결합하여 작은 개별 조직 샘플에 대한 전사체 데이터 세트를 생성합니다. 이 기술을 통해 우리는 전통적인 세포 분류 방법을 사용하여 연구 할 수없는 조직이나 종에서 유전자 발현을 연구 할 수 있습니다. 추가적으로, 벌크 RNA-seq 접근법보다 더 특이성을 제공한다.
여기서 우리는 C.elegans 네 번째 애벌레 단계 수컷과 hermaphrodites의 네 개의 세포 꼬리 팁에 대해이 기술을 시연했습니다. 그러나이 접근법의 아름다움은 모델이 아닌 종에도 적용 할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Raya Jallad와 현재 테네시 주 채터누가에있는 베일러 학교의 생물 의학 과학자 인 Antonio Herrera 박사입니다.
먼저 분출하지 않고 플레이트 벽에 대해 하나 ~ 두 밀리리터의 M9 버퍼를 부드럽게 피펫팅하십시오. 웜을 제거하기 위해 접시를 소용돌이 치십시오. 구멍이 뚫리지 않도록 한천 가장자리의 플레이트 벽에 피펫 팁을 배치하여 모든 액체와 웜을 제거하고 버립니다.
이 비디오는 어머니와 애벌레가 제거되기 전에 접시를 보여줍니다. 산모와 애벌레가 제거 된 후에 배아 만 남겨 두어야합니다. L1 유충은 1 시간 정도 배양 한 후에 나타나기 시작합니다.
그런 다음 접시를 섭씨 25도에 놓습니다. 한 시간 후, 플레이트를 인큐베이터에서 제거한다. 조심스럽게 1 밀리리터의 M9 버퍼를 한천에 떨어 뜨리고 플레이트를 소용돌이 치며 배아가 아닌 L1을 제거합니다.
튜브를 원심분리하고 L1s를 피펫팅하여 시드된 플레이트의 박테리아 잔디밭 상에 직접 피펫한다. 웜을 섭씨 25도에서 유지하십시오. 30 ~ 50 X 배율의 해부 현미경으로 동기화 플레이트에서 수컷과 헤르마프로디트를 별도의 비장착 플레이트로 채취하기 시작하십시오.
수컷은 헤르마프로디테 꼬리의 뾰족한 모양과 어두운 색에 비해 수컷 꼬리의 부풀어 오른 모양과 밝은 색으로 hermaphrodite와 구별됩니다. 0.01 % 세제를 함유 한 M9 버퍼로 미리 세척 된 피펫 팁을 사용하여 1 ~ 2 밀리리터의 M9 버퍼로 플레이트에서 웜을 씻어냅니다. 웜을 1 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 1 분 동안 회전시키고 M9 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오.
다시 한 분 동안 회전하십시오. 얼음처럼 차가운 70 % 메탄올 한 밀리리터를 넣고 잘 섞으십시오. 한 밀리리터 메탄올로 세척을 반복하고 잘 섞으십시오.
그것을 한 분 동안 회전시키고 70 % 메탄올 500 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그것을 섞어서 섭씨 네 도에서 한 시간에서 하룻밤 사이에 보관하십시오. 20 마이크로리터의 웜을 폴리에틸렌 나프탈레이트 또는 PEN-멤브레인 유리 슬라이드의 코팅된 측면 상에 고정된 피펫.
메탄올이 증발 할 때까지 기다리십시오. 스테이지 위의 플라스틱 실드를 제거하고 위쪽 화살표가 있는 언로드 버튼을 클릭하여 멤브레인 슬라이드를 로드합니다. 슬라이드가 완전히 건조되었는지 확인하고 멤브레인이 아래를 향하도록 뒤집고 슬라이드를 삽입하십시오.
변경 표본 창에서 계속을 클릭합니다. 슬라이드 홀더가 이동합니다. 그런 다음 화면 하단의 플라스틱 실드를 교체하고 슬라이드가 포함 된 슬라이드 홀더를 선택하고 아래쪽 화살표가있는 언로드 버튼을 클릭하여 튜브를로드하십시오.
트레이를 당겨 튜브 블록을 분리합니다. 네 개의 500 마이크로리터 PCR 튜브의 튜브 캡을 홀더에 넣고 튜브를 아래로 접습니다. 블록을 트레이로 되돌리고 트레이를 현미경 스테이지로 다시 밀어 넣습니다.
변경 수집기 장치 팝업 창에서 PCR 튜브를 선택하고 확인을 클릭합니다. 콜렉터 장치 튜브 캡 아래의 화면 왼쪽 하단의 빈 튜브 위치를 클릭하고 현미경 제어판에서 투과 된 밝은 필드 조명을 위해 TLBF를 선택하십시오. 2.5X 렌즈를 사용하여 웜과 PEN-멤브레인의 표면 구조가 보일 때까지 초점을 조정합니다.
20X 렌즈로 전환하고 스테이지를 웜이 없는 영역으로 이동합니다. 멤브레인의 기포와 같은 구조가 노란색을 띠도록 초점을 조정하여 레이저를 올바른 초점면에 초점을 맞춘 다음 레이저 매개 변수를 설정하십시오. 꼬리 팁의 경우 속도 20에서 전원 45 조리개 30으로 시작하십시오.
레이저 컨트롤 패널에서 보정을 선택하고 지침을 따릅니다. 다음으로, 컬렉터 장치 튜브 캡에서 화면 하단에서 위치 A를 클릭하고 화면의 오른쪽에서 단일 모양을 선택한 다음 그리기 및 잘라냅니다. 그런 다음 점할 점을 선택하고 선을 그립니다.
시작 컷을 클릭하여 레이저가 멤브레인을 통과하도록 합니다. 웜을 찾아 이동하고 자르십시오. 마우스를 사용하여 꼬리를 자릅니다.
샘플을 수집하려면 점 간 기능을 사용하여 그리기 및 잘라내기 설정으로 전환하고 모양 그리기를 수행하여 멤브레인 섹션의 절단을 완료합니다. 화면 하단의 컬렉터 장치 튜브 캡에서 다음 튜브를 선택하고 다음 꼬리 팁을 자릅니다. 네 개의 꼬리가 잘리면 아래쪽 화살표로 언로드를 클릭하여 튜브 랙을 언로드합니다.
해부 현미경 아래에서 막 섹션을 찾고 다운스트림 샘플 처리를 계속하십시오. 여기서 CEL-Seq2로 RNA 시퀀싱. 1.2 마이크로리터의 CEL-Seq2 프라이머 마스터 믹스를 피펫 샘플 위에 직접 놓고 튜브를 닫는다.
프라이머 번호로 라벨링하고 즉시 튜브 캡을 드라이 아이스 조각에 직접 올려 놓고 샘플을 플래시하여 RNA 분해를 방지합니다. 모든 샘플이 수집될 때까지 반복합니다. 마지막으로 튜브를 영하 70도에 보관하십시오.
부화 후 21 ~ 23 시간에 C.elegans L3 hermaphrodite와 수컷은 꼬리의 형태학에 의해 해부 현미경으로 구별 될 수 있습니다. hermaphrodite의 이야기는 좁고 남성의 이야기는 부어 오르고 분명하게 보입니다. PEN-멤브레인 슬라이드 구조와 웜 테일의 외관이 이러한 이미지에 표시됩니다.
여기서 초점은 현미경의 20X 및 40X 렌즈에 맞습니다. PEN-멤브레인을 공평하게 잘라낸 해부된 꼬리가 여기에서 볼 수 있다. 컷의 틈새를 닫은 후, 멤브레인 조각은 슬라이드 아래의 튜브 캡으로 떨어집니다.
해부된 테일 팁을 포함하는 PEN-멤브레인 섹션이 있는 튜브 캡이 여기에 표시됩니다. 그래픽 이미지는 서로 다른 시점 및 성별에 대한 개별 꼬리 팁당 자연 로그 변환된 고유 분자 식별자 또는 UMI 카운트를 나타냅니다. powsimR 소프트웨어는 다양한 발현 수준에서 차등 발현 또는 DE 유전자를 검출하기 위해 얼마나 많은 독립적인 샘플이 필요한지를 결정하는 데 사용됩니다.
여기의 그래픽 이미지는 조건별로 서로 다른 샘플 크기를 통합하는 네 가지 시뮬레이션에 대해 두 조건 사이의 DE 유전자를 검출하는 진정한 양성률을 나타냅니다. 파선은 80%참 양수율을 나타냅니다. 잘못된 발견률과 동일한 네 가지 시뮬레이션이 여기에 표시됩니다.
파선은 10%거짓 검색률을 나타냅니다. 그래프는 조건당 70개의 꼬리 팁의 샘플 크기가 매우 낮은 발현 수준을 갖는 유전자를 제외하고는 DE 유전자를 검출하기에 충분하다는 것을 보여주었다. 적절한 동기화를 위해서는 배아 만 플레이트에 있는지 확인하십시오.
샘플 손실을 방지하기 위해 프라이머를 피펫으로 캡의 PEN-멤브레인 섹션에 직접 혼합하고 캡을 닫을 때 매우 부드럽습니다. 종에 구애받지 않기 때문에이 프로토콜을 사용하여 다른 종의 상동 구조에 대해 유전자 조절 네트워크가 어떻게 진화했는지 탐구 할 수 있습니다.
