Combinamos microdisseção de captura a laser com um protocolo de busca de RNA de célula única chamado CEL-Seq2 para gerar conjuntos de dados transcriômicos para pequenas amostras de tecido individual. Esta técnica nos permite estudar a expressão genética em tecidos ou espécies que não podem ser estudadas usando métodos tradicionais de classificação celular. Além disso, fornece mais especificidade do que uma abordagem RNA-seq em massa.
Aqui demonstramos esta técnica para as quatro pontas de cauda celular de C.elegans quarto estágio machos e hermafroditas. Mas a beleza dessa abordagem é que ela pode até ser aplicada a espécies não modelo. Demonstrando o procedimento estarão a Sra. Raya Jallad, doutoranda do meu laboratório e dr. Antonio Herrera, atualmente cientista biomédico líder na escola Baylor em Chattanooga, Tennessee.
Comece por uma tubulação suave de um a dois mililitros de tampão M9 contra a parede da placa sem esguichar. Gire a placa para desalojar os vermes. Remova e descarte todo o líquido e os vermes colocando a ponta da pipeta contra a parede da placa na borda do ágar para evitar furar.
Este vídeo mostra a placa antes que as mães e a larva sejam removidas. Somente embriões devem ser deixados após a retirada das mães e da larva. A larva L1 começará a aparecer após a incubação por uma hora ou mais.
Em seguida, coloque a placa a 25 graus Celsius. Após uma hora, retire a placa da incubadora. Solte cuidadosamente um mililitro de tampão M9 no ágar e gire a placa para desalojar os L1s, mas não os embriões.
Centrifugar o tubo e pipeta os L1s diretamente no gramado bacteriano de uma placa semeada. Mantenha os vermes a 25 graus Celsius. Sob um microscópio de dissecção de 30 a 50 X, comece a escolher os machos e os hermafroditas das placas de sincronização em placas separadas não seladas.
Os machos são distinguidos das hermafroditas pela forma salientes e cor mais clara das caudas masculinas em comparação com a forma pontiaguda e a cor mais escura das caudas hermafroditas. Lave os vermes da placa com um a dois mililitros de tampão M9 usando uma ponta de pipeta pré-lavada com tampão M9 contendo detergente de 0,01%. Transfira os worms para um tubo de centrífuga de um mililitro, gire por um minuto e adicione um mililitro de tampão M9.
Mais uma vez, gire por um minuto. Adicione um mililitro de gelo frio 70% de metanol e misture bem. Repita a lavagem com um mililitro de metanol, misture bem.
Gire-o por um minuto e adicione 500 microliters de 70% de metanol. Misture-o e armazene-o a quatro graus Celsius por uma hora para a noite. Pipeta 20 microliters dos vermes fixos no lado revestido de um naftato de polietileno ou deslizamento de vidro de membrana PEN.
Espere o metanol evaporar. Remova o escudo plástico sobre o palco e clique no botão de descarga com a seta para cima para carregar as lâminas da membrana. Certifique-se de que o slide está completamente seco, vire para que a membrana esteja virada para baixo e insira o slide.
Clique para continuar na janela do espécime de alteração. O suporte de slides se moverá. Em seguida, substitua o escudo plástico, na parte inferior da tela, escolha qual porta-slides contém o slide e clique no botão de descarga com a seta para baixo para carregar os tubos.
Puxe a bandeja para fora e remova o bloco do tubo. Insira as tampas do tubo de quatro tubos PCR de 500 microliter no suporte e dobre o tubo sob. Volte o bloco para a bandeja e deslize a bandeja de volta para o estágio do microscópio.
Na janela popup do dispositivo de coletor de alterações, selecione tubos PCR e clique bem. Clique no local vazio do tubo no canto inferior esquerdo da tela sob tampas do tubo do dispositivo coletor e no painel de controle do microscópio selecione TLBF para iluminação de campo brilhante transmitido. Usando a lente 2.5X, ajuste o foco até que os vermes e a estrutura superficial da membrana PEN sejam visíveis.
Mude para a lente 20X e mova o palco para uma região sem vermes. Ajuste o foco de modo que as estruturas semelhantes à bolha na membrana tenham uma cor amarelada para focar o laser no plano focal correto e, em seguida, definir os parâmetros de laser. Para as pontas traseiras, comece com potência 45 abertura 30 na velocidade 20.
No painel de controle a laser, selecione calibrar e siga as instruções. Em seguida, na parte inferior da tela em tampas de tubo do dispositivo coletor clique na posição A, no lado direito da tela selecione a forma única, seguido de desenho e corte. Em seguida, selecione ponto a ponto e desenhe uma linha.
Clique em iniciar o corte para que o laser corte através da membrana. Encontre um verme e mude para se mover e cortar. Use o mouse para cortar a cauda.
Para coletar a amostra, mude para a configuração de desenho e corte com a função ponto a ponto e desenhe a forma para completar o corte de uma seção de membrana. Selecione o próximo tubo na tampa do tubo do dispositivo coletor na parte inferior da tela e corte a próxima ponta da cauda. Uma vez que quatro caudas são cortadas, descarregue o rack do tubo clicando em descarregar com a seta para baixo.
Encontre as seções de membrana sob um microscópio dissecando e continue com o processamento da amostra a jusante. Aqui sequenciamento rna com CEL-Seq2. Pipetas 1.2 microliters de uma mistura master de primer CEL-Seq2 diretamente em cima da amostra e feche o tubo.
Rotule com o número do primer e coloque imediatamente a tampa do tubo diretamente em um pedaço de gelo seco para congelar a amostra, evitando assim a degradação do RNA. Repita até que todas as amostras tenham sido coletadas. Finalmente armazene os tubos a menos 70 graus Celsius.
C.elegans L3 hermafroditas e machos de 21 a 23 horas após a escotilha podem ser distinguidos sob um microscópio de dissecção pela morfologia de suas caudas. A história da hermafrodita é estreita enquanto a dos machos está inchada e parece clara. O aparecimento da estrutura de lâminas de membrana PEN e da cauda de verme é mostrado nestas imagens.
Aqui o foco está correto para as lentes 20X e 40X no microscópio. A cauda dissecada imparcialmente cortou a membrana PEN são visíveis aqui. Depois de fechar a abertura do corte, a peça de membrana cairá na tampa do tubo abaixo do slide.
Uma tampa de tubo com uma seção de membrana PEN contendo uma ponta de cauda dissecada é mostrada aqui. A imagem gráfica representa o registro natural transformado em identificador molecular exclusivo ou contagem umi por ponta de cauda individual para diferentes pontos de tempo e sexos. O software powsimR é usado para determinar quantas amostras independentes são necessárias para detectar genes diferenciados expressos ou DE em vários níveis de expressão.
A imagem gráfica aqui representa a verdadeira taxa positiva para detectar os genes DE entre duas condições para quatro simulações diferentes incorporando diferentes tamanhos de amostra por condição. A linha tracejada indica uma taxa positiva de 80%. A taxa de falsa descoberta e as mesmas quatro simulações são mostradas aqui.
A linha tracejada indica uma taxa de descoberta 10% falsa. Os gráficos mostraram que um tamanho amostral de 70 pontas traseiras por condição é suficiente para detectar os genes DE, exceto para os genes com níveis de expressão muito baixos. Para uma sincronização adequada, certifique-se de que apenas embriões estejam presentes na placa.
Para garantir contra a perda da amostra, pipeta a cartilha misturar diretamente na seção de membrana PEN na tampa e ser extremamente suave no fechamento da tampa. Por ser agnóstico de espécies, podemos usar este protocolo para explorar como as redes de regulação genética evoluíram para estruturas homólogas em diferentes espécies.
