يسمح هذا البروتوكول بتحديد كمية قطرات الدهون وتحليل مورفولوجيتها وتوزيعها تحت الخلوي بطريقة محددة من نوع الألياف. تمكن هذه التقنية من المعالجة المتزامنة للعضلات المختلفة ، مما يوفر الوقت ويتجنب القطع الأثرية التي يمكن أن تحدث عند معالجتها بشكل مستقل. كما يسمح بأتمتة كمية قطرات الدهون.
تم تقييم التنكس العضلي في العضلات البحرية ، ولكن يمكن ترجمة هذا البروتوكول إلى البشر في ظروف مختلفة ، مثل السمنة والشيخوخة والسرطان. قد يكون التعرف على نفس الألياف في القسم المتوازي أمرا صعبا ، لكن الهياكل الرائعة مثل تعديلات المحور العصبي أو مغزل العضلات هي معالم جيدة ستساعد الباحث على تحديد موقع نفس الألياف على كلتا الشريحتين. للبدء في وضع مقطعين عرضيين مجمدين بالتبريد التسلسلي لعينة العضلات على شريحتين لاصقتين محددتين مسبقا.
شريحة واحدة لتحديد أنواع الألياف والأخرى لتحديد محتوى الدهون. للكشف الكيميائي النسيجي المناعي لنوع الألياف العضلية ، أحط الأقسام بمخطط مخطط مرسوم بقلم مسعور. ضعه في غرفة رطبة ، واشطفه بالثلج البارد 0.1 PBS لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بإزالة PBS ، وأضف محلول الحظر إلى الشريحة ، واحتضن لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق إزالة محلول حجب واحتضان الشرائح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، في درجة حرارة الغرفة.
يضاف المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية وتحضن الشرائح في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، فيما يلي تأكد من إبقاء الشريحة بعيدا عن الضوء والمضي قدما في عمليات الغسيل الثلاثة في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها، ثم شطف الشريحة في ماء مقطر مزدوج، بعد إزالة الماء الزائد، قم بتركيب الشريحة بكاشف مضاد للتلاشي وتخزينها عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. لتلطيخ قطرة الدهون بالجسم ، أحط قسم العضلات بمخطط رسمه قلم مسعور قبل شطفه بالثلج البارد 0.1 PBS المولي لمدة 10 دقائق. يجب تلطيخ كلتا الشريحتين في وقت واحد.
إصلاح القسم مع البرد أربعة في المئة بارافورمالدهيد دون الميثانول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الشطف السريع الأول ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. امنع الشريحة باستخدام مصل الماعز العادي بنسبة 5٪ في PBS لمدة ساعة واحدة في الغرفة البشرية.
يليه احتضان الشريحة بمحلول الجسم المضاد الأساسي الذي يتكون من مصل الماعز الطبيعي بنسبة 2٪ ومضاد اللامينين للفئران في PBS لمدة 90 دقيقة. بعد غسل الشرائح ثلاث مرات في PBS ، قم بإجراء الحضانة التالية باستخدام محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي يحتوي على الماعز ، مضاد للفئران ، Alexa fluor 647 الجسم المضاد في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تأكد من حماية الشريحة من الضوء.
بعد الحضانة ، اغسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد ذلك ، احتضن القسم لمدة 20 دقيقة باستخدام محلول dapi و bodipy. بعد الشطف السريع ، اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، ومرة واحدة بالماء المقطر المزدوج ، ثم قم بإزالة الماء الزائد وتركيب القسم باستخدام كاشف مضاد للتلاشي.
بمجرد مسح العضلات ضوئيا ، قم بتحميل الصور الرقمية الملتقطة في أي برنامج لمعالجة الصور لإعادة الإعمار. استنادا إلى مورفولوجيا الألياف والأنسجة في قسم العضلات ، احفظ الصورة بتنسيق مناسب مع دمج جميع القنوات. لمراقبة الصورة الجسدية واكتسابها، قم بتعيين معلمات المجهر البؤري، مع عدسة هدف غمر الزيت 40 × وفتحة عددية تبلغ 1.4، كما هو موضح في المخطوطة.
لتجنب الحديث المتبادل بين bodipy و 558 ، 568 ، و laminin Alexa fluor 647 ؛ استخدم وضع المسح المتسلسل على البرنامج البؤري. إثارة الجسم و 493 ، 503 باستخدام خط الليزر 488 نانومتر أو خط ليزر الأرجون ، وإثارة bodipy و 555 ، 568 باستخدام خط ليزر الصمام الثنائي 561 نانومتر. أخيرا ، اكتشف laminin Alexa fluor 647 باستخدام خط ليزر ثنائي الصمام الثنائي 640 نانومتر ، اعتمادا على الصبغة المختارة ، وحدد معدلات الانبعاثات عند 570 إلى 650 نانومتر للجسم و 493،503.
وعند 565 إلى 620 نانومتر للجسم و 558 ، 568. اضبط نطاق انبعاث اللامينين عند 656 إلى 700 نانومتر. بعد ذلك ، اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب لتجنب اكتشاف وحدات البكسل المشبعة على مؤشر النطاق.
قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة. لتحديد نوع الألياف على المجهر البؤري ، استخدم جهاز كمبيوتر محمول يمكن من خلاله التحقق من صورة الشريحة التي أعيد بناؤها مسبقا مع الكشف المناعي عن نوع الألياف. بمجرد تحديد مجموعة من الألياف بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات bodipy و laminin.
افتح كل صورة بمساعدة مستورد التنسيق الحيوي من فيجي. ضمن الخيار مكدس العرض مع تحديد مكدس تشعبي، ثم وضع اللون والافتراضي. تأكد من تحديد نافذة القياس التلقائي.
استخدم أداة الاختيار اليدوي الحر لتحديد ساركوليما الألياف يدويا بناء على قناة اللامينين. واضغط على T على لوحة المفاتيح لتسجيل منطقة الاهتمام في نافذة عائد الاستثمار. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل وتعيين القياسات.
ثم في النافذة المنبثقة ، حدد المنطقة وبالنسبة للقطر المرتفع ، اترك المربعات المتبقية دون تحديد والمعلمات الأخرى كما تظهر افتراضيا. انقر على القياس في نافذة عائد الاستثمار للحصول على المساحة والحد الأدنى للقطر المرتفع للألياف المحددة ولاحظها لاستخدامها لاحقا. احسب قيمة سدس الحد الأدنى للقطر المرتفع لتحديد الجزء المركزي من الألياف.
انقر فوق نافذة عائد الاستثمار ، انقر فوق إضافة للحصول على نسخة مكررة من عائد الاستثمار الأول وحدد عائد الاستثمار الثاني الذي يظهر على النافذة. في النافذة الرئيسية لفيجي ، انقر فوق تحرير ، ثم حدد وتكبير. لتقديم القيمة المحسوبة مسبقا مع علامة ناقص قبل الرقم وانقر فوق موافق.
في نافذة عائد الاستثمار ، انقر فوق إضافة ، ويجب أن يظهر عائد استثمار ثالث ، واحذف لحذف عائد الاستثمار الثاني. في نافذة عائد الاستثمار ، حدد كل من عائد الاستثمار وانقر فوق المزيد من ZOR وأضف ، وانتظر حتى يظهر عائد استثمار ثالث يتوافق مع محيط الألياف. إذا كانت هناك حاجة إلى إعادة تحليل نفس الألياف ، فاحفظ عائد الاستثمار بالنقر فوق المزيد ثم حفظه.
حدد القناة الجسدية وافتح أداة العتبة بالنقر فوق علامات تبويب الصور والضبط والعتبة في النافذة الرئيسية في فيجي. في النافذة المنبثقة عتبة تعيين القيم إلى 70 و 255. ثم حدد YEN وطريقة الأبيض والأسود.
قبل النقر على خلفية داكنة. وأخيرا اضغط على علامة التبويب تطبيق. انتقل إلى النافذة الرئيسية في فيجي وانقر على تحليل وتعيين القياسات.
في النافذة المنبثقة، حدد المساحة وجزء المساحة والحد من العتبة. اترك المربعات والمعلمات المتبقية افتراضيا. انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار وحدد عائد الاستثمار الأول.
في النافذة الرئيسية في فيجي ، انقر فوق أداة التحليل ، ثم تحليل الجسيمات. في نافذة الجسيمات التي تم تحليلها ، قم بتعيين القيم من اثنين إلى ما لا نهاية وحدد مربع البكسل. احتفظ بقيمة التعميم الافتراضية وحدد تلخيص قبل النقر فوق موافق.
للحصول على قيم المركز ومحيط الألياف ، كرر تحديد عائد الاستثمار الثاني والثالث في كل مرة. ثم احفظ النتائج بالنقر فوق ملف ، ثم احفظها كما في نافذة الملخص. قم بتضمين نوع الألياف على اسم الملف.
يسمح هذا البروتوكول الكيميائي النسيجي المناعي بالتعرف على الفئران ، والألياف المؤكسدة البطيئة ، مثل النوع 1 و 2A ، والألياف السكرية السريعة ، مثل النوع 2X و 2B ، ووجود الألياف الهجينة. من خلال قياس المساحة والحد الأدنى للقطر المرتفع لألياف العضلات ، تم تطبيق تقليل يعتمد على الحجم للحصول على المناطق المركزية والطرفية لكل ألياف. الهياكل الرائعة لكل قسم عضلي ، مثل أغصان المحور العصبي أو مغزل العضلات هي معالم جيدة يمكن أن تساعد في تحديد موقع نفس الألياف على كلا الجانبين.
الإعدادات الموصوفة للحصول على تلطيخ اللامينين الجسدي بواسطة المجهر البؤري. يسمح بتصور وتحليل حجم وعدد وتوزيع قطرات الدهون من ثلاثة إلى ستة ألياف في وقت واحد. سمحت الطريقة أيضا بتحديد كمية ثلاثة معلمات مهمة ، وهي النسبة المئوية لمساحة الألياف التي تشغلها قطرات الدهون ، والكثافة ، ومتوسط حجم قطرات الدهون.
أدى إجراء التجميد غير السليم والفشل في تحقيق درجة الحرارة المناسبة للإيزوبنتان إلى تكوين بلورة ثلجية داخل ألياف العضلات. عندما لم تتم محاذاة الأقسام المستعرضة ، لم يكن من الممكن إجراء قياس كمية قطرات الدهون والمقارنة بين الألياف أو العضلات أو الحيوانات. يجب أن تتم معالجة الشريحة الثانية في وقت واحد مع الأولى.
تجفيف الشريحة بالهواء بعد التقسيم بالتبريد لمدة 15 دقيقة سيقلل بشكل كبير من حجم وعدد قطرات الدهون. يمكن استخدام Bodipy لدراسة تفاعل قطرات الدهون مع العضيات تحت الخلوية الأخرى ، أو كومة البروتين مع التألق من طيف مختلف ، أو مع نماذج GFP المعدلة وراثيا. تم الإبلاغ عن أن التنخر العضلي هو عامل تنبؤ ضعيف للعديد من الأمراض.
لذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة تطور المرض أو لتقييم تأثير العلاج.
