Questo protocollo consente la quantificazione delle goccioline lipidiche e l'analisi della loro morfologia e distribuzione subcellulare in modo specifico per tipo di fibra. Questa tecnica consente l'elaborazione simultanea di diversi muscoli, risparmiando tempo ed evitando artefatti che potrebbero verificarsi se elaborati in modo indipendente. Permette inoltre l'automatizzazione della quantificazione delle goccioline lipidiche.
La miosteatosi è stata valutata nei muscoli marini, ma questo protocollo potrebbe essere tradotto negli esseri umani in diverse condizioni, come l'obesità, l'invecchiamento e il cancro. Riconoscere le stesse fibre in sezione parallela potrebbe essere difficile, ma strutture notevoli come le modifiche agli assoni o i fusi muscolari sono buoni punti di riferimento che aiuteranno il ricercatore a localizzare le stesse fibre su entrambe le diapositive. Per iniziare posizionare due sezioni trasversali crio congelate seriali del campione muscolare su due vetrini di adesione pre-etichettati.
Una diapositiva per determinare i tipi di fibre e l'altra per quantificare il contenuto lipidico. Per il rilevamento immunoistochimico del tipo di fibra muscolare, circondare le sezioni con un contorno disegnato con una penna idrofoba. Metterlo in una camera umida e risciacquare con PBS molare 0,1 molare ghiacciato per un minuto a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere il PBS, aggiungere la soluzione di blocco al vetrino e incubare per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente rimuovere la soluzione bloccante e incubare i vetrini per 90 minuti a 37 gradi Celsius con la soluzione contenente gli anticorpi primari. Lavare le diapositive tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente.
Aggiungere la soluzione contenente gli anticorpi secondari e incubare i vetrini al buio per un'ora a temperatura ambiente, in seguito assicurarsi di tenere il vetrino lontano dalla luce e procedere con i tre lavaggi in PBS per cinque minuti ciascuno, quindi risciacquare il vetrino in acqua a doppio distillato, dopo aver rimosso l'acqua in eccesso, montare il vetrino con reagente antideflagrante e conservarlo a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Per macchiare la goccia lipidica con bodipy, circondare la sezione muscolare con un contorno disegnato da una penna idrofoba prima di risciacquarla con PBS molare 0,1 molare ghiacciato per 10 minuti. Entrambe le diapositive devono essere macchiate contemporaneamente.
Fissare la sezione con paraformaldeide fredda al quattro percento senza metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo il primo risciacquo rapido lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti. Bloccare il vetrino con siero di capra normale al 5% in PBS per un'ora nella camera umana.
Seguito dall'incubazione del vetrino con la soluzione dell'anticorpo primario comprendente il 2% di siero di capra normale e antilaminina di ratto in PBS per 90 minuti. Dopo aver lavato i vetrini tre volte in PBS, effettuare la successiva incubazione con la soluzione anticorpale secondaria contenente capra, anti-ratto, anticorpo Alexa fluor 647 in PBS a temperatura ambiente per un'ora. Assicurarsi che la diapositiva sia protetta dalla luce.
Dopo l'incubazione lavare il vetrino tre volte con PBS. Quindi, incubare la sezione per 20 minuti con dapi e soluzione corporea. Dopo un rapido risciacquo, lavare tre volte con PBS e una volta con acqua doppia distillata, quindi rimuovere l'acqua in eccesso e montare la sezione con un reagente anti-dissolvenza.
Una volta scansionato il muscolo, carica le immagini digitali acquisite in qualsiasi software di elaborazione delle immagini per la ricostruzione. In base alla morfologia della fibra e all'istologia della sezione muscolare, salvare l'immagine in un formato adatto con tutti i canali uniti. Per l'osservazione e l'acquisizione di immagini corporee, impostare i parametri per un microscopio confocale, con una lente ad immersione in olio 40 X e un'apertura numerica di 1,4, come descritto nel manoscritto.
Per evitare la diafonia tra bodipy e 558, 568 e laminina Alexa fluor 647; Utilizzare la modalità di scansione sequenziale sul software confocale. Eccita bodipy e 493, 503 usando la linea laser a 488 nanometri o la linea laser argon ed eccita bodipy e 555, 568 usando la linea laser a diodi a 561 nanometri. Infine, rilevare la laminina Alexa fluor 647 con una linea laser a diodi da 640 nanometri, a seconda del colorante scelto, impostare i tassi di emissione da 570 a 650 nanometri per bodipy e 493,503.
E a 565-620 nanometri per bodipy e 558.568. Impostare l'intervallo di emissione per la laminina da 656 a 700 nanometri. Quindi, impostare il guadagno e il guadagno digitale in modo appropriato per evitare di rilevare pixel saturi sull'indicatore di intervallo.
Correggere il segnale di sfondo regolando l'offset. Per identificare il tipo di fibra sul microscopio confocale, utilizzare un laptop su cui è possibile controllare l'immagine del vetrino precedentemente ricostruito con il rilevamento immuno di tipo fibra. Una volta identificato correttamente un gruppo di fibre acquisire l'immagine con i canali bodipy e laminina.
Apri ogni immagine con l'aiuto dell'importatore del bioformato dalle Figi. Sotto l'opzione stack di viste con selezionare hyper stack, quindi modalità colore e impostazione predefinita. Assicurarsi che la finestra di ridimensionamento automatico sia selezionata.
Utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per selezionare manualmente il sarcolemma della fibra in base al canale della laminina. E premi T sulla tastiera per registrare la regione di interesse nella finestra ROI. Vai alla finestra principale delle Figi e fai clic su Analizza e imposta le misurazioni.
Quindi nella finestra popup selezionare l'area e per il diametro rialzato, lasciare le caselle rimanenti deselezionate e altri parametri come appaiono per impostazione predefinita. Fare clic su misura nella finestra ROI per ottenere l'area e il minimo per il diametro rialzato della fibra selezionata e annotarli per un uso successivo. Calcola il valore di un sesto del minimo per diametro rialzato per delimitare la parte centrale della fibra.
Fai clic sulla finestra ROI, fai clic su aggiungi per avere un duplicato del primo ROI e seleziona il secondo ROI che appare nella finestra. Nella finestra principale di Fiji, fai clic su Modifica, quindi seleziona e ingrandisci. Per introdurre il valore calcolato in precedenza con un segno meno prima del numero e fare clic su OK.
Nella finestra ROI, fai clic su aggiungi, deve apparire un terzo ROI ed elimina per eliminare il secondo ROI. Nella finestra ROI selezionare entrambi i ROI e fare clic su altro quindi ZOR e aggiungere, attendere che appaia un terzo ROI che corrisponda alla periferia della fibra. Se è necessaria una nuova analisi delle stesse fibre, salvare il ROI facendo clic su altro e quindi su Salva.
Seleziona il canale bodipy e apri lo strumento soglia facendo clic sulle schede immagine, regolazione e soglia nella finestra principale delle Figi. Nella finestra popup di soglia impostare i valori su 70 e 255. Quindi selezionare YEN e metodo in bianco e nero.
Prima di cliccare su sfondo scuro. Infine premi la scheda Applica. Vai alla finestra principale delle Figi e fai clic su Analizza e imposta le misurazioni.
Nella finestra popup, selezionare area, frazione di area e limitare alla soglia. Lasciare le caselle e i parametri rimanenti come predefiniti. Vai alla finestra ROI e seleziona il primo ROI.
Nella finestra principale delle Figi fare clic su Analizza, quindi sullo strumento Analizza particelle. Nella finestra delle particelle analizzate impostare i valori da due a infinito e selezionare la casella dei pixel. Mantenere il valore di circolarità predefinito e selezionare Riepilogo prima di fare clic su OK.
Per ottenere i valori del centro e della periferia della fibra, ripetere ogni volta la selezione del secondo e del terzo ROI. Quindi salva i risultati facendo clic su file, quindi salva come nella finestra di riepilogo. Includi il tipo di fibra sul nome del file.
Questo protocollo immunoistochimico consente il riconoscimento di topi, fibre ossidative lente, come il tipo 1 e 2A, fibre glicolitiche veloci, come il tipo 2X e 2B, e la presenza di fibre ibride. Misurando l'area e il minimo per il diametro rialzato della fibra muscolare è stata applicata una riduzione dipendente dalle dimensioni per ottenere le aree centrali e periferiche di ciascuna fibra. Strutture notevoli di ogni sezione muscolare, come ramoscelli assonali o fusi muscolari sono buoni punti di riferimento che potrebbero aiutare a localizzare le stesse fibre su entrambi i lati.
Le impostazioni descritte per l'acquisizione della colorazione della laminina corporea mediante microscopia confocale. Consentita, la visualizzazione e l'analisi delle dimensioni, del numero e della distribuzione delle goccioline lipidiche da tre a sei fibre contemporaneamente. Il metodo ha anche permesso la quantificazione di tre parametri importanti, vale a dire la percentuale dell'area della fibra occupata dalle goccioline lipidiche, la densità e la dimensione media delle goccioline lipidiche.
Una procedura di congelamento impropria e il mancato raggiungimento della giusta temperatura di isopentano hanno provocato una formazione di cristalli di ghiaccio all'interno delle fibre muscolari. Quando le sezioni non erano allineate trasversalmente, la quantificazione delle goccioline lipidiche e il confronto tra fibre, muscoli o animali non potevano essere eseguiti. L'elaborazione della seconda diapositiva deve essere eseguita contemporaneamente alla prima.
L'asciugatura all'aria del vetrino dopo la criosezione per 15 minuti ridurrà significativamente le dimensioni e il numero di goccioline lipidiche. Bodipy può essere utilizzato per studiare l'interazione di goccioline lipidiche con altri organelli subcellulari, o stack proteici con fluorescenza di uno spettro diverso, o con modelli GFP geneticamente modificati. La miosteatosi è stata segnalata come un fattore prognostico scarso per diverse malattie.
Pertanto, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per monitorare la progressione di una malattia o per valutare l'effetto di un trattamento.
