Este protocolo permite la cuantificación de las gotas lipídicas y el análisis de su morfología y distribución subcelular de forma específica al tipo de fibra. Esta técnica permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando artefactos que podrían ocurrir cuando se procesan de forma independiente. También permite la automatización de la cuantificación de las gotas lipídicas.
La miosteatosis se evaluó en los músculos marinos, pero este protocolo podría traducirse a los humanos en diferentes afecciones, como la obesidad, el envejecimiento y el cáncer. Reconocer las mismas fibras en la sección paralela podría ser difícil, pero estructuras notables como los ajustes del axón o los husos musculares son buenos puntos de referencia que ayudarán al investigador a localizar las mismas fibras en ambas diapositivas. Para comenzar, coloque dos secciones transversales criocongeladas en serie de la muestra muscular en dos portaobjetos de adhesión preetiquetados.
Una diapositiva para determinar los tipos de fibra y la otra para cuantificar el contenido de lípidos. Para la detección inmunohistoquímica del tipo de fibra muscular, rodee las secciones con un contorno dibujado con una pluma hidrofóbica. Colóquelo en una cámara húmeda y enjuague con PBS molar 0.1 frío durante un minuto a temperatura ambiente.
A continuación, retire el PBS, agregue la solución de bloqueo a la diapositiva e incube durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Más tarde retire la solución de bloqueo e incube los portaobjetos durante 90 minutos a 37 grados centígrados con la solución que contiene los anticuerpos primarios. Lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno, a temperatura ambiente.
Agregue la solución que contiene los anticuerpos secundarios e incube los portaobjetos en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente, a continuación asegúrese de mantener el portaobjetos alejado de la luz y proceda con los tres lavados en PBS durante cinco minutos cada uno, luego enjuague el portaobjetos en agua destilada doble, después de eliminar el exceso de agua, monte el portaobjetos con reactivo antifas y guárdelo a cuatro grados centígrados protegido de la luz. Para manchar la gota lipídica con corpulóptero, rodee la sección muscular con un contorno dibujado por una pluma hidrofóbica antes de enjuagarla con PBS molar 0.1 helado durante 10 minutos. Ambas diapositivas deben mancharse simultáneamente.
Fije la sección con paraformaldehído al cuatro por ciento frío sin metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del primer enjuague rápido, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos. Bloquee el portaobjetos con suero de cabra normal al 5% en PBS durante una hora en cámara humana.
Seguido de la incubación del portaobjetos con la solución del anticuerpo primario que comprende un 2% de suero normal de cabra y anti-laminina de rata en PBS durante 90 minutos. Después de lavar los portaobjetos tres veces en PBS, realice la siguiente incubación con la solución secundaria de anticuerpos que contiene cabra, anti-rata, anticuerpo Alexa fluor 647 en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Asegúrese de que la diapositiva esté protegida de la luz.
Después de la incubación, lave el portaobjetos tres veces con PBS. A continuación, incubar la sección durante 20 minutos con dapi y solución bodipy. Después de un enjuague rápido, lave tres veces con PBS, y una vez con agua destilada doble, luego retire el exceso de agua y monte la sección con un reactivo antidesvanecimiento.
Una vez que se escanea el músculo, cargue las imágenes digitales capturadas en cualquier software de procesamiento de imágenes para la reconstrucción. En función de la morfología de la fibra y la histología de la sección muscular, guarde la imagen en un formato adecuado con todos los canales fusionados. Para la observación y adquisición de imágenes corporales, establezca los parámetros para un microscopio confocal, con una lente de objetivo de inmersión en aceite de 40 X y una apertura numérica de 1.4, como se describe en el manuscrito.
Para evitar la diafonía entre bodipy y 558, 568, y laminina Alexa fluor 647; Utilice el modo de escaneo secuencial en el software confocal. Excitar bodipy y 493, 503 usando la línea láser de 488 nanómetros o línea láser de argón, y excitar bodipy y 555, 568 usando la línea láser de diodo de 561 nanómetros. Finalmente, detectar laminina Alexa fluor 647 con una línea láser de diodo de 640 nanómetros, dependiendo del tinte elegido, establecer las tasas de emisión en 570 a 650 nanómetros para bodipy y 493, 503.
Y a 565 a 620 nanómetros para bodipy y 558, 568. Establezca el rango de emisión de laminina en 656 a 700 nanómetros. A continuación, configure la ganancia y la ganancia digital de manera adecuada para evitar detectar píxeles saturados en el indicador de rango.
Corrija la señal de fondo ajustando el desplazamiento. Para identificar el tipo de fibra en el microscopio confocal, use una computadora portátil en la que se pueda verificar la imagen de la diapositiva previamente reconstruida con la detección de inmunodetección de tipo fibra. Una vez que un grupo de fibras se identifica correctamente adquiere la imagen con los canales bodipy y laminin.
Abra cada imagen con la ayuda del importador del bioformato de Fiji. En la vista pila con opción, seleccione hyper stack, luego color mode y default. Asegúrese de que la ventana de escala automática esté seleccionada.
Utilice la herramienta de selección a mano alzada para seleccionar manualmente el sarcolema de la fibra en función del canal de laminina. Y presione T en el teclado para grabar la región de interés en la ventana roi. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en analizar y establecer mediciones.
Luego, en la ventana emergente, seleccione el área y para el diámetro elevado, deje las casillas restantes sin marcar y otros parámetros tal como aparecen de forma predeterminada. Haga clic en medir en la ventana roi para obtener el área y el mínimo para el diámetro elevado de la fibra seleccionada y anotarlos para su uso posterior. Calcule el valor de una sexta parte del diámetro mínimo elevado para delimitar la parte central de la fibra.
Haga clic en la ventana de ROI, haga clic en agregar para tener un duplicado del primer ROI y seleccione el segundo ROI que aparece en la ventana. En la ventana principal de Fiji, haga clic en editar, luego seleccione y amplíe. Para introducir el valor calculado previamente con un signo menos antes del número y haga clic en aceptar.
En la ventana ROI, haga clic en agregar, debe aparecer un tercer ROI y elimine para eliminar el segundo ROI. En la ventana roi, seleccione ambos ROI y haga clic en más luego en ZOR y agregue, espere a que aparezca un tercer ROI que corresponda a la periferia de la fibra. Si es necesario volver a analizar las mismas fibras, guarde el ROI haciendo clic en más y luego en guardar.
Seleccione el canal bodipy y abra la herramienta de umbral haciendo clic en las pestañas imagen, ajuste y umbral en la ventana principal de Fiji. En la ventana emergente de umbral, establezca los valores en 70 y 255. A continuación, seleccione YEN y método en blanco y negro.
Antes de hacer clic en el fondo oscuro. Finalmente presione la pestaña de aplicación. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en analizar y establecer mediciones.
En la ventana emergente, seleccione área, fracción de área y límite al umbral. Deje los cuadros y parámetros restantes como predeterminados. Vaya a la ventana roi y seleccione el primer ROI.
En la ventana principal de Fiji, haga clic en analizar, luego en la herramienta analizar partículas. En la ventana de partículas analizadas, establezca los valores de dos a infinito y marque la casilla de píxeles. Mantenga el valor de circularidad predeterminado y seleccione resumir antes de hacer clic en Aceptar.
Para obtener los valores del centro y la periferia de la fibra, repita la selección del segundo y el tercer ROI cada vez. Luego guarde los resultados haciendo clic en el archivo, luego guárdelo como en la ventana de resumen. Incluya el tipo de fibra en el nombre del archivo.
Este protocolo inmunohistoquímico permite el reconocimiento de ratones, fibras oxidativas lentas, como tipo 1 y 2A, fibras glucolíticas rápidas, como tipo 2X y 2B, y la presencia de fibras híbridas. Al medir el área y el diámetro mínimo elevado de la fibra muscular se aplicó una reducción dependiente del tamaño para obtener las áreas central y periférica de cada fibra. Las estructuras notables de cada sección muscular, como las ramitas de axón o los husos musculares son buenos puntos de referencia que podrían ayudar a localizar las mismas fibras en ambos lados.
Los ajustes descritos para adquirir la tinción de laminina corporal mediante microscopía confocal. Permitido, la visualización y análisis del tamaño, número y distribución de gotas lipídicas de tres a seis fibras simultáneamente. El método también permitió la cuantificación de tres parámetros importantes, a saber, el porcentaje del área de fibra ocupada por las gotas de lípidos, la densidad y el tamaño promedio de las gotas de lípidos.
El procedimiento de congelación inadecuado y la falta de alcanzar la temperatura correcta de isopentano dieron como resultado una formación de cristal de hielo dentro de las fibras musculares. Cuando las secciones no estaban alineadas transversalmente, no se pudo realizar la cuantificación de las gotas lipídicas y la comparación entre fibras, músculos o animales. El procesamiento de la segunda diapositiva debe hacerse simultáneamente con la primera.
El secado al aire de la diapositiva después de la crioseccion durante 15 minutos reducirá significativamente el tamaño y el número de gotas de lípidos. Bodipy se puede utilizar para estudiar la interacción de gotas lipídicas con otros orgánulos subcelulares, o pila de proteínas con fluorescencia de un espectro diferente, o con modelos GFP modificados genéticamente. Se ha informado que la miosteatosis es un factor de mal pronóstico para varias enfermedades.
Por lo tanto, esta técnica podría usarse para monitorear la progresión de una enfermedad o para evaluar el efecto de un tratamiento.
