Этот протокол позволяет количественно оценить капли липидов и проанализировать их морфологию и субклеточное распределение специфическим для типа волокна способом. Эта техника позволяет одновременно обрабатывать различные мышцы, экономя время и избегая артефактов, которые могут возникнуть при самостоятельной обработке. Это также позволяет автоматизировать количественную оценку липидных капель.
Миостеатоз был оценен в морских мышцах, но этот протокол может быть переведен на людей в различных условиях, таких как ожирение, старение и рак. Распознавание одних и тех же волокон в параллельном сечении может быть затруднено, но замечательные структуры, такие как настройки аксонов или мышечные веретена, являются хорошими ориентирами, которые помогут исследователю найти одни и те же волокна на обоих слайдах. Для начала поместите два серийных криомороженных поперечных сечения мышечного образца на два предварительно маркированных адгезионных слайда.
Один слайд для определения типов волокон, а другой для количественной оценки содержания липидов. Для иммуногистохимического обнаружения типа мышечных волокон окружите участки контуром, нарисованным гидрофобной ручкой. Поместите его во влажную камеру и промойте холодным льдом 0,1 моляра PBS в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем удалите PBS, добавьте блокирующий раствор на слайд и высиживайте в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия. Позже удаляют блокирующий раствор и инкубируют слайды в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия с раствором, содержащим первичные антитела. Трижды мойте горки PBS в течение пяти минут каждая при комнатной температуре.
Добавьте раствор, содержащий вторичные антитела, и инкубируйте слайды в темноте в течение одного часа при комнатной температуре, после чего убедитесь, что слайд удален от света и продолжайте три промывки в PBS в течение пяти минут каждая, затем промойте горку в двойной дистиллированной воде, после удаления лишней воды установите горку с антитемнечным реагентом и храните ее при четырех градусах Цельсия, защищенной от света. Чтобы окрасить липидную каплю бодипией, окружите мышечный участок контуром, нарисованным гидрофобной ручкой, прежде чем промыть его ледяным холодом 0,1 молярного PBS в течение 10 минут. Обе горки должны быть окрашены одновременно.
Зафиксируйте участок холодным четырехпроцентным параформальдегидом без метанола в течение 10 минут при комнатной температуре. После первого быстрого ополаскивания трижды промойте горки PBS в течение пяти минут. Заблокируйте слайд с 5% нормальной козьей сывороткой в PBS в течение одного часа в камере человека.
Затем следует инкубация слайда с раствором первичного антитела, содержащего 2%-ную нормальную козью сыворотку и крысиный антиламинин в PBS в течение 90 минут. После трикратного промывания слайдов в PBS проводят следующую инкубацию с раствором вторичного антитела, содержащим козье, анти-крысиное, Alexa fluor 647 антитело в PBS при комнатной температуре в течение одного часа. Убедитесь, что слайд защищен от света.
После инкубации трижды промойте горку PBS. Далее инкубируют участок в течение 20 минут с дапи и раствором бодипи. После быстрого ополаскивания трижды промойте PBS, а один раз двойной дистиллированной водой, затем удалите лишнюю воду и смонтируйте секцию с антивяхающим реагентом.
Как только мышца будет отсканирована, загрузите захваченные цифровые изображения в любое программное обеспечение для обработки изображений для реконструкции. Основываясь на морфологии волокон и гистологии мышечного отдела, сохраните изображение в подходящем формате со всеми объединенными каналами. Для наблюдения и получения телесных изображений задайте параметры для конфокального микроскопа с объективом с погружением в масло 40 X и числовой диафрагмой 1,4, как описано в рукописи.
Во избежание перекрестных помех между бодипи и 558, 568 и ламинином Alexa fluor 647; Используйте режим последовательного сканирования в конфокальном программном обеспечении. Возбуждают бодипию и 493, 503 с помощью 488-нанометровой лазерной линии или аргоновой лазерной линии, а возбуждают бодипию и 555 568 с помощью 561-нанометровой диодной лазерной линии. Наконец, обнаружение ламинина Alexa fluor 647 с помощью 640-нанометровой диодной лазерной линии, в зависимости от выбранного красителя, установило скорость излучения от 570 до 650 нанометров для бодипи и 493 503.
А при 565 до 620 нанометров для бодипи и 558 568. Установите диапазон выбросов для ламинина на уровне от 656 до 700 нанометров. Затем установите коэффициент усиления и цифровой коэффициент усиления соответствующим образом, чтобы избежать обнаружения насыщенных пикселей на индикаторе диапазона.
Исправьте фоновый сигнал, отрегулировав смещение. Для идентификации типа волокна на конфокальном микроскопе используйте ноутбук, на котором можно проверить изображение ранее реконструированного слайда с иммунодетацией типа волокна. Как только группа волокон правильно идентифицирована, приобретают изображение с бодипийским и ламининовым каналами.
Откройте каждое изображение с помощью импортера биоформата из Фиджи. Под стеком представлений с опцией выберите гиперстек, затем цветовой режим и по умолчанию. Убедитесь, что выбрано окно автоматического масштабирования.
Используйте инструмент свободного выбора вручную, чтобы вручную выбрать сарколемму волокна на основе канала ламинина. И нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы записать интересующую область в окне ROI. Перейдите в главное окно Фиджи и нажмите на анализ и установку измерений.
Затем во всплывающем окне выберите область, а для увеличенного диаметра оставьте остальные флажки снятыми, а другие параметры такими, какими они отображаются по умолчанию. Нажмите на меру на окне ROI, чтобы получить площадь и минимальный для повышенного диаметра выбранного волокна и отметить их для последующего использования. Рассчитайте значение одной шестой от минимального для поднятого диаметра, чтобы разграничить центральную часть волокна.
Нажмите на окно ROI, нажмите на добавить, чтобы иметь дубликат первого ROI и выберите второй ROI, который появится в окне. В главном окне Фиджи нажмите на редактирование, затем выберите и увеличьте. Ввести ранее рассчитанное значение со знаком минус перед числом и нажать на кнопку ОК.
В окне ROI нажмите добавить, должен появиться третий ROI и удалить, чтобы удалить второй ROI. В окне ROI выберите оба ROI и нажмите на больше, чем ZOR и добавьте, подождите, пока не появится третий ROI, который соответствует периферии волокна. Если требуется повторный анализ тех же волокон, сохраните ROI, нажав на больше, чем сохранить.
Выберите канал bodipy и откройте инструмент «Порог», щелкнув вкладки «Изображение», «Настройка» и «Порог» в главном окне Фиджи. На пороговом всплывающем окне установите значения 70 и 255. Затем выберите YEN и черно-белый метод.
Перед нажатием на темный фон. Наконец, перейдите на вкладку «Применить». Перейдите в главное окно Фиджи и нажмите на анализ и установку измерений.
Во всплывающем окне выберите область, долю области и предел порога. Оставьте остальные поля и параметры по умолчанию. Перейдите в окно ROI и выберите первый ROI.
В главном окне Фиджи нажмите на инструмент анализа, затем анализируйте частицы. В окне анализируемых частиц установите значения от двух до бесконечности и установите флажок пиксели. Сохраните значение цикличности по умолчанию и выберите Суммировать, прежде чем нажать кнопку ОК.
Чтобы получить значения центра и периферии волокна, каждый раз повторяйте выбор второго и третьего ROI. Затем сохраните результаты, нажав на файл, затем сохраните как в окне сводки. Укажите тип волокна в имени файла.
Этот иммуногистохимический протокол позволяет распознавать у мышей медленные окислительные волокна, такие как тип 1 и 2А, быстрые гликолитические волокна, такие как тип 2X и 2B, и наличие гибридных волокон. При измерении площади и минимального для повышенного диаметра мышечного волокна для получения центральной и периферической областей каждого волокна применялось размерно-зависимое уменьшение. Замечательные структуры каждого мышечного отдела, такие как аксонные веточки или мышечные веретена, являются хорошими ориентирами, которые могут помочь найти одни и те же волокна с обеих сторон.
Описаны настройки получения окрашивания бодипи-ламинина методом конфокальной микроскопии. Допускается визуализация и анализ размера, количества и распределения липидных капель от трех до шести волокон одновременно. Метод также позволил количественно оценить три важных параметра, а именно процент площади волокна, занимаемой липидными каплями, плотность и средний размер липидных капель.
Неправильная процедура замораживания и неспособность достичь правильной температуры изопентана привели к образованию кристаллов льда внутри мышечных волокон. Когда срезы не были выровнены поперечно, количественная оценка липидных капель и сравнение между волокнами, мышцами или животными не могли быть выполнены. Обработка второго слайда должна производиться одновременно с первым.
Воздушная сушка горки после криосекции в течение 15 минут значительно уменьшит размер и количество липидных капель. Бодипи могут быть использованы для изучения взаимодействия липидных капель с другими субклеточными органеллами, или белкового стека с флуоресценцией другого спектра, или с генетически модифицированными моделями GFP. Сообщается, что миостеатоз является плохим прогностическим фактором для нескольких заболеваний.
Таким образом, этот метод может быть использован для мониторинга прогрессирования заболевания или для оценки эффекта лечения.
