このプロトコルは、脂肪滴の定量化および線維型特異的な様式でのそれらの形態および細胞内分布の分析を可能にする。この技術により、異なる筋肉の同時処理が可能になり、時間を節約し、独立して処理されたときに発生する可能性のあるアーチファクトを回避できます。また、脂肪滴定量の自動化も可能になります。
筋食症は海洋筋肉で評価されましたが、このプロトコルは肥満、老化、癌などのさまざまな状態の人間に翻訳することができます。平行したセクションで同じ繊維を認識することは難しいかもしれませんが、軸索の微調整や筋肉の紡錘などの顕著な構造は、研究者が両方のスライドで同じ繊維を見つけるのに役立つ良いランドマークです。まず、筋標本の2つの連続クライオ凍結断面を2つの予め標識された接着スライド上に配置する。
1 つのスライドは繊維の種類を決定し、もう 1 つは脂質含有量を定量化します。筋線維型の免疫組織化学的検出のために、疎水性ペンで描かれた輪郭で切片を囲む。湿潤チャンバーに入れ、氷冷0.1モルPBSで室温で1分間すすいでください。
次に、PBSを取り出し、ブロッキング溶液をスライドに加え、摂氏37度で90分間インキュベートする。その後、ブロッキング溶液を取り出し、一次抗体を含む溶液と共に37°Cでスライドを90分間インキュベートする。スライドをPBSで3回、室温でそれぞれ5分間洗浄する。
二次抗体を含む溶液を加え、室温で1時間暗所でスライドをインキュベートし、その後、スライドを光から遠ざけ、PBS中で3回の洗浄をそれぞれ5分間進め、スライドを二重蒸留水ですすぎ、余分な水を除去した後、スライドを退色防止試薬で取り付け、光から保護された摂氏4度で保管する。脂肪滴を体で染色するには、筋肉部分を疎水性ペンで描いた輪郭で囲み、氷冷0.1モルPBSで10分間すすいでください。両方のスライドを同時に染色する必要があります。
メタノールを含まない冷たい4%パラホルムアルデヒドでセクションを室温で10分間固定する。最初のクイックリンスの後、スライドをPBSで5分間3回洗浄します。PBS中の5%正常ヤギ血清でスライドをヒトチャンバーで1時間ブロックします。
続いて、スライドをPBS中の2%正常ヤギ血清およびラット抗ラミニンを含む一次抗体の溶液と共に90分間インキュベートした。スライドをPBSで3回洗浄した後、PBS中でヤギ、抗ラット、Alexaフルア647抗体を含む二次抗体溶液と室温で1時間インキュベーションを行う。スライドがライトから保護されていることを確認します。
インキュベーション後、スライドをPBSで3回洗浄する。次に、セクションをダピおよびボディピ溶液で20分間インキュベートする。すすぎを軽くした後、PBSで3回洗い、2倍の蒸留水で1回洗った後、余分な水を取り除き、退色防止試薬でセクションを取り付けます。
筋肉をスキャンしたら、撮影したデジタル画像を画像処理ソフトウェアにアップロードして再構築します。筋断面の線維形態および組織学に基づいて、すべてのチャネルをマージした適切な形式で画像を保存する。ボディピー画像の観察と取得のために、原稿に記載されているように、40Xの油浸対物レンズと1.4の開口数で、共焦点顕微鏡のパラメータを設定します。
ボディピーと558、568、およびラミニンAlexaフルオール647との間のクロストークを避けるために;共焦点ソフトウェアで順次スキャン・モードを使用します。488ナノメートルレーザーラインまたはアルゴンレーザーラインを用いてボディピーおよび493、503を励起し、561ナノメートルダイオードレーザーラインを用いてボディピーおよび555、568を励起する。最後に、選択した色素に応じて、640ナノメートルのダイオードレーザーラインでラミニンAlexa蛍光647を検出し、ボディピーの場合は570〜650ナノメートル、493、503で発光速度を設定します。
そして、ボディピーについては565〜620ナノメートル、558、568である。ラミニンの発光範囲を656~700ナノメートルに設定します。次に、ゲインとデジタルゲインを適切に設定して、レンジインジケータで飽和ピクセルを検出しないようにします。
オフセットを調整してバックグラウンド信号を修正します。共焦点顕微鏡でファイバーの種類を特定するには、ファイバータイプの免疫検出で以前に再構築されたスライドの画像が確認できるラップトップを使用します。繊維のグループが正しく識別されたら、ボディピーチャンネルとラミニンチャンネルで画像を取得します。
フィジーからのバイオフォーマットの輸入業者の助けを借りて、各画像を開きます。オプション付きのビュースタックの下で、ハイパースタックを選択し、次にカラーモードとデフォルトを選択します。自動スケールウィンドウが選択されていることを確認します。
フリーハンド選択ツールを使用して、ラミニンチャネルに基づいて繊維のサルコレンマを手動で選択します。キーボードのTキーを押して、ROIウィンドウに関心領域を記録します。フィジーのメインウィンドウに移動し、[分析と測定値の設定]をクリックします。
次に、ポップアップウィンドウで領域を選択し、直径を上げる場合は、残りのボックスとその他のパラメータをデフォルトで表示されるままにします。ROIウィンドウのメジャーをクリックして、選択したファイバの面積と隆起した直径の最小値を取得し、後で使用するためにメモします。隆起直径の最小値の6分の1の値を計算して、繊維の中央部分を区切ります。
ROIウィンドウをクリックし、[追加]をクリックして最初のROIの複製を作成し、ウィンドウに表示される2番目のROIを選択します。フィジーのメインウィンドウで、[編集]をクリックし、[選択して拡大]をクリックします。以前に計算した値を数字の前にマイナス記号で導入し、[OK]をクリックします。
ROIウィンドウで、[追加]をクリックし、[3番目のROI]が表示され、削除して2番目のROIを削除します。ROI ウィンドウで両方の ROI を選択し、ZOR の次にクリックして追加し、ファイバの周辺に対応する 3 番目の ROI が表示されるのを待ちます。同じファイバーの再分析が必要な場合は、さらにクリックしてROIを保存し、保存します。
ボディピチャンネルを選択し、フィジーのメインウィンドウの画像、調整、しきい値タブをクリックしてしきい値ツールを開きます。しきい値ポップアップウィンドウで、値を 70 と 255 に設定します。次に、YENと白黒方式を選択します。
暗い背景をクリックする前に。最後に、適用タブを押します。フィジーのメインウィンドウに移動し、[分析と測定値の設定]をクリックします。
ポップアップウィンドウで、面積、面積分率、しきい値への制限を選択します。残りのボックスとパラメータはデフォルトのままにします。ROIウィンドウに移動し、最初のROIを選択します。
フィジーのメインウィンドウで[分析]をクリックし、次にパーティクルツールを分析します。解析されたパーティクルウィンドウで、2から無限大の値を設定し、[ピクセル]ボックスをオンにします。デフォルトの円形度値を維持し、「OK」をクリックする前に「要約」を選択します。
繊維の中心と周辺の値を取得するには、毎回2番目と3番目のROIの選択を繰り返します。次に、ファイルをクリックして結果を保存し、概要ウィンドウにそのまま保存します。ファイルの名前にファイバーのタイプを含めます。
この免疫組織化学的プロトコールは、マウスの認識を可能にする、1型および2A型のような遅い酸化性線維、2X型および2B型などの高速解糖系線維、およびハイブリッド線維の存在。筋線維の隆起した直径に対する面積および最小を測定することによって、サイズ依存的な縮小を適用し、各繊維の中央および周辺領域を得た。軸索小枝や筋紡錘などの各筋肉セクションの顕著な構造は、両側に同じ繊維を見つけるのに役立つ良いランドマークです。
共焦点顕微鏡によるボディピーラミニン染色の取得に関する設定について説明する。許可される、3〜6本の繊維からの脂肪滴のサイズ、数、および分布の視覚化および分析を同時に行う。この方法はまた、3つの重要なパラメータ、すなわち脂肪滴によって占める繊維面積の割合、密度、および脂肪滴の平均サイズの定量を可能にした。
不適切な凍結手順とイソペンタンの適切な温度を達成できなかった結果、筋線維内に氷結晶が形成されました。切片が横方向に整列していなかった場合、脂肪滴の定量および線維、筋肉、または動物間の比較は実行できなかった。2 番目のスライドの処理は、最初のスライドと同時に実行する必要があります。
凍結切片後のスライドを15分間風乾すると、脂肪滴のサイズと数が大幅に減少します。Bodipyは、脂肪滴と他の細胞内小器官、または異なるスペクトルの蛍光を有するタンパク質スタック、または遺伝子改変GFPモデルとの相互作用を研究するために使用することができる。筋食症は、いくつかの疾患の予後不良因子であることが報告されている。
したがって、この技術は、疾患の進行をモニターしたり、治療の効果を評価するために使用することができる。
