이 프로토콜은 지질 방울의 정량화와 섬유 유형 특정 방식으로 그들의 형태학 및 세포 내 분포의 분석을 허용한다. 이 기술은 서로 다른 근육을 동시에 처리 할 수있게하여 시간을 절약하고 독립적으로 처리 할 때 발생할 수있는 아티팩트를 피할 수 있습니다. 또한 지질 방울 정량화의 자동화를 허용합니다.
근막증은 해양 근육에서 평가되었지만,이 프로토콜은 비만, 노화 및 암과 같은 다른 조건의 인간에게 번역 될 수 있습니다. 평행 한 섹션에서 동일한 섬유를 인식하는 것은 어려울 수 있지만 축삭 비틀기 또는 근육 스핀들과 같은 주목할만한 구조는 연구자가 두 슬라이드에서 동일한 섬유를 찾는 데 도움이되는 좋은 랜드 마크입니다. 먼저 근육 표본의 두 개의 연속 냉동 냉동 단면을 두 개의 사전 라벨링된 접착 슬라이드 상에 놓는다.
하나는 섬유 유형을 결정하고 다른 슬라이드는 지질 함량을 정량화합니다. 근육 섬유 유형의 면역 조직 화학 검출을 위해, 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 섹션을 둘러 쌉니다. 이를 습한 챔버에 넣고, 실온에서 1분 동안 얼음처럼 차가운 0.1몰 PBS로 헹구었다.
다음으로, PBS를 제거하고, 블로킹 용액을 슬라이드에 첨가하고, 섭씨 37도에서 90분 동안 인큐베이션한다. 이후 블로킹 용액을 제거하고 슬라이드를 일차 항체를 함유하는 용액과 함께 섭씨 37도에서 90분 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 실온에서 각각 다섯 분 동안 PBS로 세 번 세척한다.
이차 항체가 포함된 용액을 첨가하고 실온에서 한 시간 동안 어둠 속에서 슬라이드를 인큐베이션한 후, 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨리도록 보장하고 PBS로 세 번 세척을 각각 다섯 분 동안 진행한 다음, 슬라이드를 이중 증류수로 헹구고, 과량의 물을 제거한 후, 슬라이드를 안티페이드 시약으로 장착하고 빛으로부터 보호된 섭씨 네 도에 보관한다. 지질 액적을 체디피로 염색하기 위해, 10분 동안 얼음처럼 차가운 0.1 몰 PBS로 헹구기 전에 소수성 펜에 의해 그려진 윤곽선으로 근육 섹션을 둘러싸십시오. 두 슬라이드는 동시에 염색해야 합니다.
실온에서 10 분 동안 메탄올이없는 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 섹션을 고정하십시오. 먼저 빠른 헹굼 후 슬라이드를 PBS로 세 번 세척하여 다섯 분 동안 세척한다. 슬라이드를 인간 챔버에서 한 시간 동안 PBS 중의 5% 정상 염소 혈청으로 차단한다.
이어서, 슬라이드를 PBS 중의 2%정상 염소 혈청 및 래트 항라미닌을 포함하는 일차 항체의 용액과 함께 90분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세 번 세척한 후, 실온에서 한 시간 동안 PBS 중의 염소, 항래트, 알렉사 플루오르 647 항체를 함유하는 이차 항체 용액과 함께 다음 인큐베이션을 수행한다. 슬라이드가 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다.
배양 후 슬라이드 세배를 PBS로 세척한다. 다음으로, dapi 및 bodipy 용액으로 20 분 동안 섹션을 인큐베이션하십시오. 빠른 헹굼 후, PBS로 세 번 씻고, 이중 증류수로 한 번 한 번 과량의 물을 제거하고 퇴색 방지 시약으로 섹션을 장착하십시오.
근육이 스캔되면 캡처 된 디지털 이미지를 재구성을 위해 이미지 처리 소프트웨어에 업로드하십시오. 섬유 형태학 및 근육 섹션의 조직학을 기반으로 모든 채널이 병합 된 적절한 형식으로 이미지를 저장하십시오. 보디피 이미지 관찰 및 수집을 위해 원고에 설명 된대로 40 X 오일 침지 대물 렌즈와 1.4의 숫자 조리개를 사용하여 공초점 현미경의 매개 변수를 설정하십시오.
보디피와 558, 568, 및 라미닌 알렉사 플루오르 647 사이의 누화를 피하기 위해; 공초점 소프트웨어에서 순차적 스캔 모드를 사용합니다. 보디피 및 493, 503을 488 나노미터 레이저 라인 또는 아르곤 레이저 라인을 사용하여 여기시키고, 561 나노미터 다이오드 레이저 라인을 사용하여 보디피 및 555, 568을 여기시킨다. 마지막으로, 선택한 염료에 따라 640 나노 미터 다이오드 레이저 라인으로 라미닌 알렉사 플루오르 647을 감지하여 보디피의 경우 570 ~ 650 나노 미터로 방출 속도를 설정하고 493, 503으로 설정합니다.
및 보디피에 대해 565 내지 620 나노미터이고 558, 568이다. 라미닌의 방출 범위를 656 ~ 700 나노 미터로 설정하십시오. 그런 다음 범위 표시기에서 포화 픽셀이 감지되지 않도록 게인과 디지털 게인을 적절하게 설정하십시오.
오프셋을 조정하여 배경 신호를 수정합니다. 공초점 현미경에서 섬유의 유형을 확인하려면, 섬유 유형 면역 검출과 함께 이전에 재구성 된 슬라이드의 이미지를 확인할 수있는 노트북을 사용하십시오. 섬유 그룹이 올바르게 식별되면 보디피 및 라미닌 채널로 이미지를 획득하십시오.
피지에서 바이오 포맷의 수입업자의 도움으로 각 이미지를 엽니 다. 옵션이있는 뷰 스택에서 하이퍼 스택을 선택한 다음 색상 모드와 기본값을 선택하십시오. 자동 크기 조정 창이 선택되어 있는지 확인합니다.
자유로운 손 선택 도구를 사용하여 라미닌 채널을 기반으로 섬유의 사르콜레마를 수동으로 선택하십시오. 키보드의 T를 눌러 ROI 창에 관심 영역을 기록합니다. 피지의 메인 창으로 이동하여 분석을 클릭하고 측정을 설정하십시오.
그런 다음 팝업 창에서 영역을 선택하고 지름을 올린 경우 나머지 상자를 선택하지 않고 다른 매개 변수를 기본적으로 나타나는 그대로 둡니다. ROI 창에서 측정을 클릭하여 선택한 섬유의 제기 된 직경에 대해 면적과 최소값을 얻고 나중에 사용할 수 있도록 기록하십시오. 섬유의 중앙 부분을 구분하기 위해 상승된 직경에 대한 최소 여섯 번째 값을 계산합니다.
ROI 창을 클릭하고 추가를 클릭하여 첫 번째 ROI를 복제하고 창에 나타나는 두 번째 ROI를 선택하십시오. 피지의 메인 창에서 편집을 클릭 한 다음 선택 및 확대를 클릭하십시오. 숫자 앞에 빼기 기호가있는 이전에 계산 된 값을 소개하고 확인을 클릭하십시오.
ROI 창에서 추가를 클릭하고 세 번째 ROI가 나타나야 하며 삭제하여 두 번째 ROI를 삭제합니다. ROI 창에서 두 ROI를 모두 선택하고 ZOR 이상을 클릭하고 추가 한 다음 섬유의 주변에 해당하는 세 번째 ROI가 나타날 때까지 기다립니다. 동일한 섬유를 다시 분석해야하는 경우 더 많은 것을 클릭하여 ROI를 저장 한 다음 저장하십시오.
bodipy 채널을 선택하고 피지의 메인 창에서 이미지, 조정 및 임계 값 탭을 클릭하여 임계 값 도구를 엽니 다. 임계값 팝업 창에서 값을 70과 255로 설정합니다. 그런 다음 엔과 흑백 방법을 선택하십시오.
어두운 배경을 클릭하기 전에. 마지막으로 적용 탭을 누르십시오. 피지의 메인 창으로 이동하여 분석을 클릭하고 측정을 설정하십시오.
팝업 창에서 영역, 영역 부분을 선택하고 임계값으로 제한합니다. 나머지 상자와 매개 변수는 기본값으로 둡니다. ROI 창으로 이동하여 첫 번째 ROI를 선택합니다.
피지의 메인 창에서 분석을 클릭 한 다음 입자 도구를 분석하십시오. 분석된 파티클 창에서 값을 두 개에서 무한대로 설정하고 픽셀 상자를 선택합니다. 기본 원형 값을 유지하고 확인을 클릭하기 전에 요약을 선택합니다.
섬유의 중심과 둘레의 값을 얻으려면 매번 두 번째 및 세 번째 ROI의 선택을 반복하십시오. 그런 다음 파일을 클릭하여 결과를 저장 한 다음 요약 창에서와 같이 저장하십시오. 파일 이름에 광섬유 유형을 포함합니다.
이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스, 타입 1 및 2A와 같은 느린 산화 섬유, 타입 2X 및 2B와 같은 빠른 글리콜 섬유, 및 하이브리드 섬유의 존재를 인식할 수 있게 한다. 근섬유의 상승된 직경에 대한 면적 및 최소를 측정함으로써 크기 의존적 감소를 적용하여 각 섬유의 중앙 및 주변 영역을 구하였다. 축삭 나뭇 가지나 근육 스핀들과 같은 각 근육 부분의 놀라운 구조는 양쪽에서 동일한 섬유를 찾는 데 도움이되는 좋은 랜드 마크입니다.
공초점 현미경에 의한 보디피 라미닌 염색을 획득하기 위해 설명된 설정. 세 개에서 여섯 개의 섬유까지 지질 방울의 크기, 수 및 분포를 동시에 시각화하고 분석할 수 있습니다. 이 방법은 또한 세 가지 중요한 파라미터, 즉 지질 액적이 차지하는 섬유 영역의 백분율, 지질 액적의 밀도 및 평균 크기의 정량화를 허용했다.
부적절한 동결 절차와 이소펜탄의 적절한 온도를 달성하지 못하면 근육 섬유 내부에 얼음 결정이 형성되었습니다. 절편이 횡단으로 정렬되지 않았을 때 지질 액적 정량화 및 섬유, 근육 또는 동물 간의 비교는 수행될 수 없었다. 두 번째 슬라이드의 처리는 첫 번째 슬라이드와 동시에 수행되어야 합니다.
15분 동안 동결절편 후 슬라이드를 공기 건조하면 지질 액적의 크기 및 수가 크게 감소할 것이다. Bodipy는 지질 방울과 다른 세포 소기관, 또는 단백질 스택과 다른 스펙트럼의 형광 또는 유전자 변형 GFP 모델과의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 근막증은 여러 질병에 대한 예후 불량 인자로 보고되었다.
따라서이 기술은 질병의 진행을 모니터링하거나 치료 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
