يصف هذا البروتوكول طريقة للتصور في الجسم الحي وثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للخلايا التي تحتفظ بالتسمية لمكانة الخلايا الجذعية القاطعة للفأر. هذه التقنية موفرة للوقت وسهلة الاستخدام للمتعلمين الجدد. يتم الحصول على صور 3D دون الإضرار بالأنسجة.
الكمي 3D يجعل البيانات أكثر موثوقية ودقة. للبدء ، تشريح الفك السفلي. ثبت العينات في 4٪ بارافورمالدهيد ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
بعد الحضانة ، قم بإزالة العضلات من الفك السفلي. اغمرها في محلول حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك 0.5 مولار لإزالة الكلس لمدة أربعة أيام مع تغيير متوسط يومي على شاكر 37 درجة مئوية. قم بإزالة لون الفك السفلي في 15 ملليلتر من محلول كوادرول 25٪ على شاكر 37 درجة مئوية ليوم واحد لإزالة الهيم الدموي المتبقي.
لتلطيخ 5-إيثينيل -2-برايم-ديوكسييوريدين كامل ، قم بإعداد كوكتيل جديد لوضع العلامات 5-إيثينيل -2-برايم ديوكسييوريدين كما هو مذكور في النص. اشطف الفك السفلي بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات باستخدام Tween 20 أو PBST لمدة 30 دقيقة على شاكر بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. كرر شطف الفك السفلي بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث ثلاث دقائق لكل منهما ، متبوعا بالحضانة في كوكتيل 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine طازج على شاكر طوال الليل.
كرر الغسيل الملحي المخزن بالفوسفات ثلاث مرات ، وقم بإجراء إزالة الدهون التسلسلية عن طريق وضع الفك السفلي في المحاليل المذكورة في النص لمدة ست ساعات لكل منها في شاكر 37 درجة مئوية. قم بتجفيف الفك السفلي في محلول ثلاثي البيوتانول والبولي إيثيلين جلايكول ، أو tB-PEG ، لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع التغيير اليومي المتوسط. بعد يومين ، قم بإزالة الفك السفلي في وسط إزالة البنزيل بنزوات البولي إيثيلين جلايكول الذي يحتوي على 75٪ بنزوات البنزيل ، و 22٪ من البولي إيثيلين جلايكول ميثيل إيثر ميثاكريلات بمتوسط 500 أو PEG-MMA500 ، و 3٪ كوادرول للحصول على مطابقة معامل الانكسار وحتى يتم تحقيق الشفافية.
قم بتركيب الفك السفلي الكامل الذي تم تطهيره من الأنسجة على شرائح تجويف العلامة التجارية في وسط إزالة البنزيل بنزوات البولي إيثيلين جلايكول ، وقم بتغطيته بشرائح غطاء زجاجي. في برنامج التصوير متحد البؤر ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصور المطلوبة. في لوحة الإثارة الفلورية ، قم بتنشيط الليزر المطلوب لإثارة الفلوروفورات على النحو الأمثل.
في لوحة اكتشاف الفلورسنت ، حرك شريط التمرير لتحديد الأطوال الموجية المراد قياسها. أضف قطرة من زيت الغمر بمعامل انكسار 1.52 أعلى غطاء الغطاء لتتناسب مع معامل الانكسار لانزلاق الغطاء الزجاجي والهدف ، وضع الفك السفلي المثبت على مرحلة المجهر. قم بتشغيل مصابيح الفلورسنت ، واختر هدف تكبير مناسب لتصوير مناطق الاهتمام.
في وضع المسح المباشر ، حدد مجال الرؤية لتصور المنطقة بأكملها من الفك السفلي في أبعاد X و Y. قم بتعيين معلمات اكتساب المرحلة Z العلوية والسفلية التي تغطي بدقة حجم مكانة الخلايا الجذعية في قاطعة الفئران. استخدم حجم خطوة Z من 2 ميكرومتر أو حسب متطلباتك.
الحصول على ملفات صور Z-stack وحفظها بتنسيق lif. استخدم محول ملفات برنامج تصوير لتحويل ملف الصورة Z-stack إلى نوع ملف التنسيق الأصلي. في برنامج التصوير، انقر على زر الساحة، ثم اختر صورة.
حدد ملف lif الأصلي ، واختر الملف المدمج. سيتم استيراد الصور إلى برنامج التصوير. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف المدرج لفتح مجموعة بيانات الصورة.
في برنامج التصوير، تفضل بزيارة لوحة ضبط الشاشة. في لوحة ضبط العرض ، انقر فوق اسم القناة. عادة ما يتم تصنيفه على أنه أحمر في الوضع الافتراضي.
في نافذة خصائص الصورة ، انقر فوق علامة التبويب اللون المعين. في خيار ملف علامة تبويب اللون ، اختر Fire Flow ، ثم انقر فوق موافق. حدد لون العرض لتمييز مضان الخلفية والتألق الإيجابي من العينة. في الجانب العلوي الأيسر من الشاشة ، في جزء خصائص المشهد ، انقر فوق الرمز الأزرق المسمى إضافة سطح جديد.
قم بإلغاء تحديد أيقونة مستوى الصوت لإزالة معظم مضان الخلفية ، مما يؤدي إلى التألق الإيجابي المرئي بوضوح أثناء التجزئة اليدوية. بعد ذلك ، ابدأ التقسيم اليدوي لمنطقة الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، بالنقر فوق علامة التبويب إنشاء وتحديد علامة التبويب تخطي الإنشاء التلقائي ، والتحرير يدويا. في معالج إنشاء السطح اليدوي ، انقر فوق علامة التبويب كفاف لاختيار الاتجاه بناء على العينات لتحديد عائد الاستثمار بسهولة.
بعد ذلك ، تأكد من أن قائمة المؤشر في الزاوية اليمنى في وضع التحديد. اضبط موضع الشريحة لتحديد موقع عائد الاستثمار في الأنسجة. كما ذكرنا سابقا ، تمت إزالة معظم مضان الخلفية بالفعل.
انقر فوق الزر "رسم" ، وارسم منطقة اهتمام مؤقتة. حدد خيار الرؤية إلى لا شيء لتجنب التداخل من مناطق أخرى غير عائد الاستثمار، متبوعا بتقسيم منطقة الاهتمام شريحة تلو الأخرى. بعد الانتهاء من رسم عائد الاستثمار ، انقر فوق إنشاء Surface للحصول على هندسة 3D لعائد الاستثمار.
انقر فوق الزر تحرير في معالج إنشاء السطح اليدوي ، وحدد قناع الكل. في نافذة قناع القناة المنبثقة ، حدد القناة 1 في خيارات اختيار القناة. بعد ذلك ، حدد تكرار القناة قبل تطبيق القناع.
في إعدادات القناع ، حدد ثابت داخل / خارج ، واضبط السطح الخارجي للفوكسل على الصفر. في جزء خصائص المشهد، قم بإلغاء تحديد كائن Surface، وحدد كائن وحدة التخزين. في معايرة العرض، قم بإلغاء تحديد القناة الحمراء الأصلية، وحدد القناة الحمراء المقنعة.
وضبط كثافة اللون للحصول على المطلوب 3D المقدمة ووصفت إيجابيا مضان ROI. قم بإنشاء كائن بقعة جديد بالنقر فوق رمز البقع لتحديد خلايا الاحتفاظ بالتسمية المقدمة ثلاثية الأبعاد عن طريق إنشاء بقع ثلاثية الأبعاد تتداخل بشكل مماثل مع خلايا الاحتفاظ بالتسمية ثلاثية الأبعاد. استخدم الأسهم السفلية للتنقل بين الخطوات في معالج إنشاء البقعة.
انقر فوق الزر "إنهاء" ، وحدد الزر "إحصائية". بعد ذلك ، حدد علامة التبويب "الإجمالي" للعثور على قيمة العدد الإجمالي للبقع في الصورة. بعد وضع العلامات على 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine وعملية إزالة الأنسجة لنظام المذيبات المرتبط بالبولي إيثيلين جلايكول ، تم الحصول على الفك السفلي الشفاف.
تمت مقارنة العينة المعدلة بالفك السفلي العادي دون عملية إزالة الأنسجة ، وتم إخضاع الفك السفلي الشفاف مع وضع العلامات على 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine للتصوير متحد البؤر. أظهر القسم البصري من القاطعة خلايا الاحتفاظ بالتسمية في مكانة الخلايا الجذعية لقمة القاطعة في المستوى XY. أظهر بناء الصورة ثلاثية الأبعاد لقمة قاطعة 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine خلايا جذعية هادئة تحتفظ بالتسمية الإيجابية في كل من مكانة الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة.
تم نقل الخلايا الإيجابية 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine إلى أماكن للقياس الكمي تتداخل نسبيا مع خلايا الاحتفاظ بالتسمية الوسيطة. تظهر البقع التي تم إنشاؤها فقط لخلايا الاحتفاظ بالتسمية الوسيطة وفقط لخلايا الاحتفاظ بالتسمية الظهارية في الصورة. كما تم إجراء تقدير كمي للخلايا الظهارية والوسيطة التي تحتفظ بالعلامات.
خصائص المعالجة والمقاصة هي أهم الخطوات ويجب تحسينها وفقا لاستخدام الأنسجة للحصول على نتائج مرضية. يمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لتصور LRCs على مستوى S2VGFP وفي تتبع نسب الخلية للحصول على تفاصيل حول موقع النسل وكميتها أو مساهماتها.
