نوعية استعداد تعليق خلية واحدة أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة وموثوق بها لأي منهجية omics خلية واحدة. وهذا البروتوكول سوف تظهر لك كيفية عزل الخلايا بسرعة، بلطف، وبقوة من الأنسجة حتى صعبة للغاية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو معالجة الأنسجة المبسطة التي تمكن من انفصال الأنسجة وعزل الخلايا عن عدد كبير من العينات في وقت قصير بجودة مثالية.
على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها للأسنان الماوس والإنسان، فإنه يمكن أيضا تطبيقها على الأنسجة الأخرى خارج الخلية مصفوفة الغنية، بما في ذلك الغضاريف والعظام، أو النسيج الضام الكثيف. إجراء عزل لب الأسنان من أسنان الإنسان وخاصة الماوس هو التحدي يدويا. ننصح الجميع باختبار ذلك قبل بدء التجارب الحقيقية.
للبدء، عقد الماوس القتل الرحيم وراء رأسه يبحث على الجانب البطني من رأسه بحيث يشير الذيل بعيدا. باستخدام مقص صغير وحاد، وإزالة الجلد بسرعة من الفك السفلي لفضح قوس الفك السفلي، والأنسجة الرخوة بين كل نصف الفك السفلي وعضلات الوجه المجاورة. لجعل قطع عميق من كل جانب من الفك السفلي، وقطع أولا من خلال مدلكة على طول الجانب buccal من الفك السفلي تصل إلى المفصل المؤقت ثم قطع على طول الجزء الداخلي من كل نصف الفك السفلي من خلال قاعدة تجويف الفم.
قطع جميع العضلات والأربطة على طول الفك السفلي حتى المفصل المؤقت من خارج وداخل تجويف الفم. فهم الفك السفلي باستخدام ملاقط طرف عازمة وإزالتها. ثم مع مقص، وقطع من خلال البرمائيات الفك السفلي لتقسيم الفك السفلي تشريح إلى نصفين.
استخدام مسح الوبر منخفضة الصناعية لغضب الأنسجة الرخوة المتبقية من كل نصف الفك السفلي. بعد تنظيف كلا الجزءين من الفك السفلي ، ضعهما في طبق بيتري معد مسبقا مع HBSS بارد الجليد. لتشريح القواطع الفك السفلي، وإزالة التلال السنفية مع جميع الأضراس الثلاثة والكراك عرضية قوس الفك السفلي في المكان المقابل للموضع بين الضرس الأول والثاني.
سحب بعناية القاطع من بقية مقبس الأسنان. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الأجزاء المتبقية من العظام المرفقة بالقاطع بالملاقط والمشرط. وضع القواطع تشريح في الجليد الطازج HBSS الباردة.
بعد تشريح الأنسجة ذات الاهتمام، ضع الأنسجة الرخوة المتشرخة في قطرة من الثلج الطازج البارد HBSS في منتصف طبق بيتري 10 سنتيمترات المحفوظة على الجليد. باستخدام شفرة مشرط مستديرة الشكل رقم 10 ، اقطع الأنسجة إلى أصغر قطع ممكنة. بعد إعادة تجميع قطع الأنسجة في منتصف القطيرات ، قطع الأنسجة بشكل متكرر مع نفس شفرة المشرط وتكرار هذه العملية حتى يتم فرم المادة بما فيه الكفاية.
نقل قطع الأنسجة الممزقة باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد إلى خليط الهضم المعدة مسبقا. ثم ضع الأنبوب بزاوية 60 درجة وحدد السرعة إلى 150 إلى 200 دورة في الدقيقة لضمان حركات التعليق المستمر داخل الأنبوب واحتضانها لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد كل ثلاث إلى أربع دقائق أثناء الحضانة، قم بتمليك التعليق بقوة باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد لتفكيك جميع الكتل.
في نهاية الحضانة ، بعد ترطيب تعليق الخلية للمرة الأخيرة ، أضف ببطء محلول الغسيل البارد الجليدي إلى حجم نهائي قدره 12 ملليلتر. الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية ومن ثم إزالة بعناية supernatant مع ماصة المصلية 10 ملليلتر. Resuspend بيليه في محلول الغسيل لتحقيق التركيز النهائي من 700 إلى 1، 200 خلية لكل ميكرولتر.
تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر لإزالة الكتل المتبقية أو قطعة من الأنسجة المتكلسة والحفاظ على الأنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة. ثم لفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت، قم بتحميل الخلايا في أنبوب معد. قم بتحميل الأنبوب في مفرز الخلية ووضع استراتيجية صارمة لإزالة حطام الخلية والمزدوجات والخلايا الميتة كما هو موضح في مخطوطة النص.
أولا، تم استخدام تلطيخ الأجسام المضادة CD45 وتحليل FACS اللاحق لتوضيح عدد الخلايا المناعية في التعليق النهائي للخلية الواحدة. كطريقة مجانية ، تم تحليل العدد الإجمالي للخلايا المناعية الإيجابية CD45 في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. باستخدام FACS، تم تحديد 14.44٪ CD45 خلايا إيجابية.
أظهر تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن 10.9٪ من الخلايا المعبرة عن CD45 وانخفاض الخلايا في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية يمكن أن يكون سببه عتبة إضافية أثناء تحليل التسلسل. الأشياء الرئيسية هي يجري بسرعة والحفاظ على هذه الأنسجة أو الخلايا على الجليد كلما كان ذلك ممكنا. يمكن أن يكون عدد الخلايا المعزولة منخفضا جدا خاصة أثناء عزل ضرس الماوس.
تجنب فقدان الخلايا. تقليل وقت عزل الخلية الواحدة مهم جدا لنجاح جميع التجارب ذات الخلية الواحدة. وهذه الطريقة المحددة سمحت حقا للحد من هذا الوقت وتمهيد الطريق لنوع خلايا الأسنان عالية الجودة للفأر والنظم البشرية.
