Этот протокол описывает метод in vivo и трехмерной визуализации и количественного определения клеток, удерживающих метки, ниши стволовых клеток резцов мыши. Этот метод экономит время и удобен для новых учеников. 3D-изображения получаются без повреждения тканей.
Количественная 3D-оценка делает данные более надежными и точными. Для начала препарируйте нижние челюсти. Зафиксируйте образцы в 4% параформальдегиде и держите их при комнатной температуре в течение ночи.
После инкубации удалите мышцы с челюстей. Погрузите их в 0,5-молярный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты для удаления накипи в течение четырех дней с ежедневной сменой среды на шейкере с температурой 37 градусов Цельсия. Обесцвечивайте мандибулы в 15 миллилитрах 25% раствора квадрола на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного дня, чтобы удалить оставшийся гем крови.
Для окрашивания 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина приготовьте свежий коктейль с маркировкой 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина, как указано в тексте. Промойте нижние челюсти фосфатно-буферным физиологическим раствором с Tween 20 или PBST в течение 30 минут на шейкере с температурой 37 градусов по Цельсию. Повторите промывку челюстей фосфатно-буферным физиологическим раствором трижды в течение трех минут каждая, а затем инкубацию в свежеприготовленном коктейле с маркировкой 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина на шейкере в течение ночи.
Повторите промывку фосфатно-солевым раствором три раза и выполните последовательную делипидизацию, поместив мандибулы в растворы, упомянутые в тексте, на шесть часов каждый в шейкер с температурой 37 градусов Цельсия. Обезвоживайте мандибулы в растворе трет-бутанола-полиэтиленгликоля или tB-PEG в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия с суточной сменой среды. Через два дня очистите нижнюю челюсть в среде для очистки бензилбензоата-полиэтиленгликоля, содержащей 75% бензилбензоата, 22% полиэтиленгликоля-метилэфира метакрилата в среднем 500 или ПЭГ-ММА500 и 3% квадрола, чтобы получить соответствие показателя преломления и до достижения прозрачности.
Установите очищенную от ткани всю нижнюю челюсть на предметные стекла полости марки в среде для очистки бензилбензоата и полиэтиленгликоля и накройте ее предметными стеклами. В программном обеспечении для конфокальной визуализации установите желаемые параметры получения изображения. В панели флуоресцентного возбуждения активируйте лазер, необходимый для оптимального возбуждения флуорофоров.
На панели для обнаружения флуоресценции переместите ползунок, чтобы выбрать длины волн для измерения. Добавьте каплю иммерсионного масла с показателем преломления 1,52 поверх покровного стекла, чтобы оно соответствовало показателю преломления стеклянного покровного стекла и объектива, и поместите установленную нижнюю челюсть на столик микроскопа. Включите люминесцентные лампы и выберите подходящий объектив увеличения для интересующих областей изображения.
В режиме сканирования в реальном времени определите поле зрения, чтобы визуализировать всю область нижней челюсти в измерениях X и Y. Установите верхнюю и нижнюю ступени Z-ступени, которые точно покрывают объем ниши стволовых клеток в резце мышей. Используйте размер шага Z в два микрометра или в соответствии с вашими требованиями.
Получение и сохранение файлов изображений Z-stack в формате LIF. Используйте конвертер файлов программного обеспечения для обработки изображений, чтобы преобразовать файл изображения Z-stack в файл собственного формата. В программном обеспечении для обработки изображений нажмите кнопку «Арена», затем выберите «Изображение».
Выберите исходный файл lif и выберите объединенный файл. Изображения будут импортированы в программное обеспечение для обработки изображений. Дважды щелкните импортированный файл, чтобы открыть набор данных изображения.
В программном обеспечении для обработки изображений посетите панель «Регулировка дисплея». На панели «Настройка дисплея» нажмите на название канала. Обычно он помечен красным цветом в режиме по умолчанию.
В окне «Свойства изображения» перейдите на вкладку «Сопоставленный цвет». В параметре «Файл вкладки цвета» выберите «Огненный поток» и нажмите «ОК». Выберите цвет дисплея, чтобы отличить фоновую флуоресценцию и положительную флуоресценцию от образца. В левом верхнем углу экрана на панели «Свойства сцены» нажмите на синий значок с надписью «Добавить новую поверхность».
Снимите флажок «Громкость», чтобы удалить большую часть фоновой флуоресценции, в результате чего положительная флуоресценция будет отчетливо видна при ручной сегментации. Далее запустите ручную сегментацию интересующего региона, или ROI, нажав на вкладку «Создать» и выбрав вкладку «Пропустить автоматическое создание, редактировать вручную». В мастере ручного создания поверхности щелкните вкладку «Контур», чтобы выбрать ориентацию на основе образцов, чтобы легко определить рентабельность инвестиций.
Затем убедитесь, что меню указателя в правом углу находится в режиме выбора. Отрегулируйте положение среза, чтобы найти ROI в ткани. Как упоминалось ранее, большая часть фоновой флуоресценции уже удалена.
Нажмите кнопку «Нарисовать» и нарисуйте ориентировочную область интереса. Выберите для параметра «Видимость» значение «Нет», чтобы избежать помех из других областей, кроме ROI, а затем сегментируйте интересующую область срез за срезом. После завершения чертежа ROI нажмите «Создать поверхность», чтобы получить 3D-геометрию ROI.
Нажмите кнопку «Изменить» в мастере ручного создания поверхностей и выберите «Маскировать все». В появившемся окне «Канал маски» выберите «Канал 1» в параметрах «Выбор канала». После этого выберите «Дублировать канал» перед применением маски.
В настройках маски выберите Константа внутри/снаружи и установите воксельную внешнюю поверхность на ноль. В области «Свойства сцены» снимите флажок с объекта Surface и выберите объект «Объем». В разделе «Настройка дисплея» отмените выбор исходного красного канала и выберите красный канал в маске.
И отрегулируйте интенсивность цвета, чтобы получить желаемую рентабельность инвестиций в флуоресценцию с 3D-визуализацией и положительной маркировкой. Создайте новый точечный объект, щелкнув значок «Пятна», чтобы количественно оценить ячейки с сохранением меток в 3D-рендеринге путем создания 3D-точек, которые сопоставимо перекрываются с ячейками, сохраняющими метки в 3D-визуализации. Используйте нижние стрелки для перемещения между шагами в мастере создания точек.
Нажмите кнопку «Готово» и выберите кнопку «Статистика». Затем выберите вкладку «Общие», чтобы найти значение общего количества пятен на изображении. После мечения 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина и процесса очистки тканей системы растворителей, связанного с полиэтиленгликолем, была получена прозрачная нижняя челюсть.
Модифицированный образец сравнивали с нормальной нижней челюстью без процесса очистки тканей, а прозрачную нижнюю челюсть с 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридин-мечением подвергали конфокальной визуализации. Оптический срез резца показал клетки, удерживающие метки, в нише стволовых клеток верхушки резца в плоскости XY. Конструкция 3D-изображения верхушки резца показала 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридин, сохраняющие положительную метку, спокойные стволовые клетки как в эпителиальной, так и в мезенхимальной нише стволовых клеток.
Положительные клетки 5-этинил-2-прайм-дезоксиуридина были перенесены в пятна для количественного определения, которые сравнительно перекрывались с клетками, удерживающими мезенхимальные метки. На изображении видны пятна, созданные только для мезенхимальных клеток, удерживающих метки, и только для эпителиальных клеток, удерживающих метки. Также было проведено количественное определение эпителиальных и мезенхимальных клеток, удерживающих метки.
Свойства обработки и очистки являются наиболее важными этапами и должны быть оптимизированы в соответствии с использованием ткани для получения удовлетворительных результатов. Этот метод также может быть модифицирован для визуализации LRC уровня S2VGFP и отслеживания клеточных линий для получения подробной информации о местонахождении потомства и их количественном определении или вкладе.
