该协议描述了一种用于小鼠门牙干细胞生态位的标记保留细胞的体内和三维可视化和定量的方法。这种技术对于新学习者来说既省时又用户友好。在不损坏组织的情况下获取3D图像。
3D定量使数据更加可靠和准确。首先，解剖下颌骨。将样品固定在4%多聚甲醛中，并在室温下保存过夜。
孵育后，从下颌骨上去除肌肉。将它们浸入 0.5 摩尔乙二胺四乙酸溶液中脱钙四天，每天在 37 摄氏度的摇床上更换培养基。在15毫升25%Quadrol溶液中，在37摄氏度的摇床上使下颌骨脱色一天，以去除剩余的血红素。
对于整个安装5-乙炔基-2-初免氧尿苷染色，如文中所述，准备新鲜的5-乙炔基-2-初免脱氧尿苷标记混合物。用磷酸盐缓冲盐水在 37 摄氏度的摇床上用吐温 20 或 PBST 冲洗下颌骨 30 分钟。用磷酸盐缓冲盐水重复冲洗下颌骨三次，每次三分钟，然后在新鲜制备的 5-乙炔基-2-茴等脱氧尿苷标记混合物中在摇床上孵育过夜。
重复磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，并通过将下颌骨置于文中提到的溶液中，在37摄氏度的摇床中各6小时来进行连续脱脂。将下颌骨在叔丁醇聚乙二醇或tB-PEG溶液中脱水两天，在37摄氏度下，每天更换培养基。两天后，在含有75%苯甲酸苄酯，22%聚乙二醇-甲基醚甲基丙烯酸酯平均500或PEG-MMA500和3%Quadrol的苯甲酸苄酯-聚乙二醇清除介质中清除下颌骨，以获得折射率匹配，直到达到透明度。
将组织清除的整个下颌骨安装在苯甲酸苄酯-聚乙二醇清除介质中的品牌腔载玻片上，并用玻璃盖玻片覆盖。在共聚焦成像软件中，设置所需的图像采集参数。在荧光激发面板中，激活最佳激发荧光团所需的激光。
在荧光检测面板中，移动滑块以选择要测量的波长。在盖玻片顶部加入一滴折射率为1.52的浸油，以匹配玻璃盖玻片和物镜的折射率，并将安装的下颌骨放在显微镜载物台上。打开荧光灯，选择合适的放大倍率物镜对感兴趣区域进行成像。
在实时扫描模式下，识别视野以在 X 和 Y 维度上可视化下颌骨的整个区域。设置上和下Z阶段采集参数，以准确覆盖小鼠门牙中干细胞生态位的体积。使用两微米的 Z 步长或根据您的要求。
以 lif 格式获取并保存 Z 堆栈图像文件。使用成像软件文件转换器将 Z 堆栈图像文件转换为本机格式文件类型。在成像软件中，点按“竞技场”按钮，然后选取“影像”。
选择原始 lif 文件，然后选择合并的文件。图像将被导入成像软件。双击导入的文件以打开图像数据集。
在成像软件中，访问“显示调整”面板。在“显示调整”面板中，单击通道的名称。在默认模式下，它通常标记为红色。
在“图像属性”窗口中，单击“映射颜色”选项卡。在“颜色选项卡文件”选项中，选择“消防流”，然后单击“确定”。选择显示颜色以区分背景荧光和样品中的阳性荧光。在屏幕左上角的场景属性窗格中，单击标记为添加新表面的蓝色图标。
取消选择音量图标可去除大部分背景荧光，从而在手动分割过程中清晰可见阳性荧光。接下来，通过单击“创建”选项卡并选择“跳过自动创建，手动编辑”选项卡，开始对感兴趣区域或 ROI 进行手动细分。在手动曲面创建向导中，单击“轮廓”选项卡以根据样品选择方向，以便轻松轮廓化ROI。
接下来，确保右上角的指针菜单处于选择模式。调整切片位置以定位组织中的ROI。如前所述，大多数背景荧光已被去除。
单击“绘制”按钮，然后绘制一个暂定的感兴趣区域。选择“可见性”选项为“无”以避免来自 ROI 以外的其他区域的干扰，然后逐个切片分割感兴趣区域。ROI 绘图完成后，单击“创建曲面”以获取 ROI 的 3D 几何图形。
单击手动曲面创建向导中的“编辑”按钮，然后选择“全部遮罩”。在弹出的“蒙版通道”窗口中，在“通道选择”选项中选择“通道 1”。然后，在应用蒙版之前选择复制通道。
在蒙版设置中，选择恒定内/外，并将体素外表面设置为零。在“场景属性”窗格中，取消选择 Surface 对象，然后选择“体积”对象。在“显示调整”中，取消选择原始红色通道，然后选择“蒙版红色”通道。
并调整颜色强度以获得所需的 3D 渲染和正标记荧光 ROI。通过单击“斑点”图标创建新的专色对象，通过创建与 3D 渲染的标签保留单元相当重叠的 3D 斑点来量化 3D 渲染的标签保留单元格。使用底部箭头在点创建向导中的步骤之间移动。
单击“完成”按钮，然后选择“统计”按钮。接下来，选择“总体”选项卡以查找图像中点总数的值。经过5-乙炔基-2-初代脱氧尿苷标记和聚乙二醇相关溶剂体系组织清除处理，得到透明下颌骨。
将修改后的样品与未进行组织清除过程的正常下颌骨进行比较，并对具有5-乙炔基-2-初免脱氧尿苷标记的透明下颌骨进行共聚焦成像。门牙的光学切片在XY平面的门牙顶端的干细胞壁龛中显示出标记保留细胞。门牙顶点的3D图像构建显示，在上皮和间充质干细胞生态位中均存在5-乙炔基-2-初代脱氧尿苷阳性标记保留静止干细胞。
将5-乙炔基-2-初代脱氧尿苷阳性细胞转移到与间充质标记保留细胞相当重叠的斑点中进行定量。仅为间充质标记保留细胞和仅为上皮标记保留细胞创建的斑点在图像中可见。还对上皮和间充质标记保留细胞进行了定量。
处理和清除的性能是最重要的步骤，应根据组织的用途进行优化，以获得满意的结果。该方法也可以修改以可视化S2VGFP水平的LRCs，并在细胞谱系示踪中获取有关后代位置及其定量或贡献的详细信息。
