פרוטוקול זה מתאר שיטה להדמיה וכימות in vivo ותלת ממדית של התאים שומרי התוויות של נישת תאי גזע חותכים בעכבר. טכניקה זו חוסכת זמן וידידותית למשתמש עבור לומדים חדשים. התמונות התלת ממדיות נרכשות מבלי לפגוע ברקמה.
הכמות התלת-ממדית הופכת את הנתונים לאמינים ומדויקים יותר. כדי להתחיל, לנתח את הלסתות. תקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר במשך הלילה.
לאחר הדגירה, להסיר את השרירים מן הלסתות. לטבול אותם בתמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית 0.5 טוחנת כדי לבטל את ההסתיידות במשך ארבעה ימים עם שינוי בינוני יומי על שייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לצבוע את הלסת התחתונה ב-15 מיליליטר של תמיסת קוואדרול 25% על שייקר של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד כדי להסיר את הדם שנותר.
לצביעת הר שלם 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine, הכינו קוקטייל תיוג טרי 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine כפי שמוזכר בטקסט. שטפו את הלסת התחתונה במי מלח חוצצים פוספט עם Tween 20 או PBST במשך 30 דקות על שייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לחזור על שטיפת הלסת התחתונה במי מלח חוצצים בפוספט שלוש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת, ולאחר מכן לדגור בקוקטייל סימון טרי של 5-אתיניל-2-פריים-דאוקסיורידין על שייקר למשך הלילה.
חזור על שטיפת מי מלח חוצצת פוספט שלוש פעמים, ובצע דה-ליפדיציה סדרתית על ידי הנחת הלסת התחתונה בתמיסות המוזכרות בטקסט במשך שש שעות כל אחת בשייקר של 37 מעלות צלזיוס. יש לייבש את הלסתות בתמיסת טרט-בוטנול-פוליאתילן גליקול, או tB-PEG, למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם שינוי בינוני יומי. לאחר יומיים, נקה את הלסת התחתונה במדיום ניקוי בנזיל בנזואט-פוליאתילן גליקול המכיל 75% בנזיל בנזואט, 22% פוליאתילן גליקול-מתיל-אתר מתקרילט ממוצע 500 או PEG-MMA500, ו-3%Quadrol כדי לקבל התאמת אינדקס שבירה ועד להשגת שקיפות.
הרכיבו את הלסת התחתונה השלמה על מגלשות חלל המותג במדיום ניקוי בנזיל בנזואט-פוליאתילן גליקול, וכסו אותה בשקופיות כיסוי זכוכית. בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הגדר את הפרמטרים הרצויים לרכישת תמונה. בלוח לעירור פלואורסצנטי, הפעל את הלייזר הדרוש כדי לעורר פלואורופורים בצורה אופטימלית.
בחלונית לזיהוי פלואורסצנטי, הזז את המחוון כדי לבחור את אורכי הגל שיימדדו. מוסיפים טיפת שמן טבילה עם מקדם שבירה של 1.52 על גבי הכיסוי כדי להתאים למקדם השבירה של כיסוי הזכוכית ומטרה, ומניחים את הלסת התחתונה המותקנת על במת המיקרוסקופ. הפעילו את מנורות הפלואורסצנט ובחרו מטרת הגדלה מתאימה לתמונת אזורי עניין.
במצב סריקה חיה, זהה את שדה הראייה כדי להמחיש את כל האזור של הלסת התחתונה בממדים X ו- Y. הגדר את פרמטרי הרכישה של שלב Z העליון והתחתון המכסים במדויק את נפח נישת תאי הגזע בחותך העכברים. השתמש בגודל צעד Z של שני מיקרומטר או לפי דרישתך.
רכוש ושמור קובצי תמונה מסוג Z-stack בתבנית lif. השתמש בממיר קבצים של תוכנת הדמיה כדי להמיר את קובץ התמונה Z-stack לסוג הקובץ המקורי בתבנית המקורית. בתוכנת ההדמיה, לחץ/י על הכפתור ״ארנה״ ולאחר מכן בחר/י ״תמונה״.
בחר בקובץ ה- lif המקורי ובחר בקובץ הממוזג. התמונות ייובאו לתוכנת ההדמיה. לחצו פעמיים על הקובץ המיובא לפתיחת ערכת נתוני התמונה.
בתוכנת ההדמיה, בקר בחלונית Display Adjustment. בחלונית Display Adjustment, לחצו על שם הערוץ. הוא מסומן בדרך כלל כאדום במצב ברירת מחדל.
בחלון מאפייני תמונה, לחץ על הכרטיסייה צבע ממופה. באפשרות Color Tab File, בחר Fire Flow ולאחר מכן לחץ על OK. בחר בצבע התצוגה כדי להבחין בין פלואורסצנטיות הרקע לבין הפלואורסצנטיות החיובית מהדגימה. בצד השמאלי העליון של המסך, בחלונית מאפייני סצינה, לחץ על הסמל הכחול שכותרתו הוסף משטח חדש.
בטל את הבחירה בסמל עוצמת הקול כדי להסיר את רוב פלואורסצנטיות הרקע, וכתוצאה מכך הפלואורסצנטיות החיובית נראית בבירור במהלך סגמנטציה ידנית. לאחר מכן, התחל את הפילוח הידני של אזור העניין, או החזר השקעה, על ידי לחיצה על הכרטיסייה יצירה ובחירה בכרטיסייה דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית. באשף יצירת המשטחים הידני, לחץ על הכרטיסייה קונטור כדי לבחור את הכיוון בהתבסס על הדגימות כדי לעצב את קו המתאר של החזר ההשקעה בקלות.
לאחר מכן, ודא שתפריט המצביע בפינה השמאלית נמצא במצב בחירה. התאימו את מיקום הפרוסה כדי לאתר את החזר ההשקעה ברקמה. כאמור, רוב פלואורסצנטיות הרקע כבר הוסרה.
לחץ על כפתור ציור, וצייר אזור טנטטיבי של עניין. בחר באפשרות 'תצוגה' באפשרות 'ללא' כדי למנוע הפרעות מאזורים אחרים מלבד החזר ההשקעה, ולאחר מכן חלק את אזור העניין פרוסה אחר פרוסה. לאחר סיום ציור החזר ההשקעה, לחץ על צור משטח כדי לקבל גיאומטריה תלת-ממדית של החזר ההשקעה.
לחץ על לערוך כפתור באשף יצירת פני השטח הידני, ובחר מסיכה הכל. בחלון 'ערוץ מסיכה' שהוקפץ, בחרו 'ערוץ 1' באפשרויות 'בחירת ערוץ'. לאחר מכן, בחרו 'שכפל ערוץ' לפני החלת המסיכה.
בקביעות המסיכה, בחרו 'קבוע בפנים/בחוץ' וקבעו את משטח הווקסל החיצוני לאפס. בחלונית מאפייני סצינה, בטל את הבחירה בעצם Surface ובחר בעצם עוצמת הקול. ב'התאמת תצוגה', בטלו את הבחירה בערוץ האדום המקורי ובחרו בערוץ 'אדום מסיכה'.
וכוונן את עוצמות הצבע כדי לקבל את החזר ההשקעה הרצוי על פלואורסצנטיות בעיבוד תלת-ממד ובתווית חיובית. צור אובייקט ספוט חדש על-ידי לחיצה על סמל הספוט כדי לכמת את התאים ששמרו על תוויות שעובדו בתלת-ממד על-ידי יצירת כתמים תלת-ממדיים החופפים באופן דומה לתאים ששמרו תוויות שעובדו בתלת-ממד. השתמש בחצים התחתונים כדי לעבור בין שלבים באשף יצירת הספוט.
לחץ על כפתור סיום ובחר את סטטיסטיקה לחצן. לאחר מכן, בחרו בכרטיסייה 'כולל' כדי למצוא את הערך של מספר הכתמים הכולל בתמונה. לאחר תיוג 5-אתיניל-2-פריים-דאוקסיורידין ותהליך ניקוי הרקמה של מערכת הממס הקשור לפוליאתילן גליקול, התקבלה הלסת התחתונה השקופה.
הדגימה ששונתה הושוותה ללסת רגילה ללא תהליך ניקוי רקמות, ולסתות שקופות עם תיוג 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine עברו הדמיה קונפוקלית. החלק האופטי של החותכת הראה תאים שומרי תווית בגומחת תאי הגזע של קודקוד החותכת במישור XY. בניית התמונה התלת-ממדית של קודקוד חותך הראתה 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine חיובי שמירה על תוויות תאי גזע שקטים הן בנישת תאי גזע אפיתל והן בנישת תאי גזע מזנכימליים.
התאים החיוביים 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine הועברו לנקודות לכימות שחפפו באופן דומה לתאים שומרי התווית המזנכימליים. הכתמים שנוצרו רק עבור תאים שומרי תוויות מזנכימליים ורק עבור תאים שומרי תוויות אפיתל נראים בתמונה. כמו כן בוצע כימות של תאים שומרי תוויות אפיתל ומזנכימליים.
מאפייני העיבוד והניקוי הם השלבים החשובים ביותר ויש לייעל אותם בהתאם לשימוש ברקמה כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. ניתן גם לשנות שיטה זו כדי להמחיש LRCs ברמת S2VGFP ובמעקב אחר שושלת תאים כדי לקבל פרטים על מיקום הצאצאים וכימות או תרומות שלהם.
