تقدم هذه التقنية نهجا عمليا لتقدير المؤشرات الحيوية الوظيفية للحيوانات المنوية البشرية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي دون المساس بشكل كبير بجودة التجربة الناجمة عن أوقات الانتظار الطويلة. يمكن أن تكون هذه التقنية مجموعة أدوات عملية وموثوقة لتشخيص العقم وتقييم وظيفة الحيوانات المنوية في كل من المقعد والسرير ، وتكمل الفحص الروتيني للحيوانات المنوية. يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام منصة Accuri C6 ويمكن تطبيقه على المنصات التجارية الأخرى مع تعديلات طفيفة.
للبدء ، احتضان عينة السائل المنوي عند 37 درجة مئوية وتسييل العينة تماما لمدة ساعة واحدة. لحساب عدد خلايا الحيوانات المنوية ، امزج عينة السائل المنوي المسال جيدا ، ثم أضف 10 ميكرولترات من السائل المنوي إلى غرفة عد الحيوانات المنوية وامسح الشريحة في محلل فئة الحيوانات المنوية. عد ما لا يقل عن ست مناطق و 400 منوي لتقدير تركيز الحيوانات المنوية.
للكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، باستخدام تلطيخ الملحق 5 FITC PI ، أضف 10 إلى خلايا الحيوانات المنوية السادسة إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق خلية الحيوانات المنوية وتخلص من المادة الطافية قبل إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
بعد ذلك ، أضف ميكرولتر من ملحق FITC -5 واثنين ميكرولتر من PI. دوامة الخلايا بلطف واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام قبل وضعها في مقياس التدفق الخلوي لتحليلها. لتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، أو MMP ، باستخدام مسبار JC-1 ، أضف مرتين 10 إلى خلايا الحيوانات المنوية السادسة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق تعليق خلية الحيوانات المنوية في محلول عمل JC-1 سعة ملليلتر واحد.
دوامة بلطف الخلايا واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي التعليق ، وتجاهل الطافات وغسل بيليه مرتين مع ملليلتر واحد من PBS. بعد ذلك ، أعد تعليق خلايا الحيوانات المنوية المصبوغة في ملليلتر واحد من PBS في أنبوب مقياس التدفق الخلوي ، وضع الأنبوب على الفور في مقياس التدفق الخلوي للتحليل.
بعد ذلك ، استخدم كاربونيل سيانيد m-Chlorophenylhydrazone ، أو CCCP كعنصر تحكم إيجابي. أعد تعليق خلايا الحيوانات المنوية في ملليلتر واحد من محلول عمل CCCP ودوامة بلطف قبل الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بطرد مركزي التعليق ، وتجاهل المادة الطافية ، وتنفيذ الخطوات لتحليل MMP باستخدام مسبار JC-1 كما هو موضح.
بالنسبة لفحص بنية كروماتين الحيوانات المنوية ، أو SCSA ، قم بإذابة عينة السائل المنوي عند حمام مائي بدرجة 37 درجة مئوية وقم بتخفيفه باستخدام TNE Buffer إلى تركيز واحد إلى مرتين في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من العينة المخففة إلى أنبوب اختبار مقياس التدفق الخلوي واخلطها مع 400 ميكرولتر من المحلول الحمضي. وصمة عار العينة مع 1.2 ملليلتر من محلول البرتقال acridin.
استخدم عينة مرجعية كمعيار داخلي لإعداد مقياس التدفق الخلوي والمعايرة. خفف العينة بأربع درجات مئوية TNE Buffer إلى تركيز من واحد إلى مرتين في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر ، وقم بتنفيذ خطوات SCSA ، كما هو موضح. افتح برنامج مقياس التدفق الخلوي وابدأ تشغيل مقياس الخلايا.
لتجميع عينة بيانات، قم بتحميل عينة تحكم على مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق تشغيل لبدء تجميع البيانات. إنشاء مخططات نقطية لعرض البيانات. حدد معلمات المحور XY واعرض خطيا لتحديد البيانات.
بعد ذلك ، حدد وتطبيق بوابة متعددة الأضلاع لتحديد عدد الحيوانات المنوية لتحليلها. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، اضبط FL1 كمحور X و FL2 كمحور Y. بعد ذلك ، لعزل الخلايا الحية المبرمج أو الميتة ، انقر فوق البوابة الرباعية واسحبها لتقسيم مجموعات الحيوانات المنوية إلى أربع مجموعات محددة.
بالنسبة ل MMP ، قم بتعيين FL1 كمحور X و FL2 كمحور Y. بعد ذلك ، قم بإنشاء بوابة متعددة الأضلاع لتقسيم مجموعات الحيوانات المنوية إلى مجموعتين محددتين. بالنسبة إلى SCSA، قم بتعيين FL4 كمحور X وFL1 كمحور Y.
ارسم البوابة ، واضبط زاوية 45 درجة لاستبعاد إشارات الحطام الخلوي. احسب 10،000 خلية منوية لكل عينة من أجل موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، وتحليلات MMP و SCSA ، وقم بتعيين حد تشغيل للإشارة إلى وقت التوقف عن جمع البيانات ، ومعدل السوائل ، اعتمادا على أرقام الخلايا والعتبة للقضاء على الحطام والضوضاء. قم بتطبيق هذه الإعدادات على جميع العينات.
إذا لزم الأمر ، اضبط تعويض اللون لتصحيح امتداد الفلورسنت. قم بإعادة الماصة برفق إلى العينة قبل تحميلها على مقياس التدفق الخلوي. ثم أدخل اسم العينة وانقر فوق تشغيل.
بمجرد اكتمال التشغيل ، احفظ بيانات العينة كملف FCS عن طريق إعطاء اسم ملف لمزيد من التحليل. يظهر هنا قياس موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ FITC PI الملحق الخامس. تضمن هذا التحليل التحكم السلبي في خلايا الحيوانات المنوية غير الملوثة لتحديد التعويض والأرباع.
في عينة مع موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، تم التعبير عن النتائج كنسب مئوية من الخلايا المبرمج القابلة للحياة أو الحية المبكرة أو الخلايا النخبوتية ، موت الخلايا المبرمج المتأخرة والخلايا الميتة. تظهر هنا مجموعة الحيوانات المنوية ذات MMP المرتفع والمنخفض. أظهرت عينة السائل المنوي ذات النوعية الجيدة ارتفاع اللون البرتقالي وانخفاض مضان الأخضر.
على العكس من ذلك ، أظهرت عينة السائل المنوي ذات النوعية الرديئة تألقا برتقاليا منخفضا وأخضرا مرتفعا. يتم عرض الصور الخلوية SCSA من رجل خصب وعقيم هنا. تم تحديد عدد خلايا الحيوانات المنوية على أنه طبيعي مع استقرار عالي للحمض النووي ، ومؤشر تجزئة الحمض النووي ، وحطام الخلية.
يجب تحضين عينة السائل المنوي عند 37 درجة مئوية وتسييلها بالكامل لمدة تصل إلى ساعة واحدة.
