この手法は、長い待ち時間によって引き起こされる実験品質を大幅に損なうことなく、フローサイトメトリーによって複数のヒト精子機能バイオマーカーを推定するための実用的なアプローチを提示します。この技術は、不妊症の診断とベンチとベッドの両方での精子機能の評価のための実用的で信頼性の高いツールキットであり、定期的な精子検査を補完します。この手順は Accuri C6 プラットフォームで実行され、軽微な変更で他の商用プラットフォームに適用できます。
まず、精液サンプルを摂氏37度でインキュベートし、サンプルを1時間完全に液化します。精子細胞をカウントするには、液化精液サンプルを完全に混合し、10マイクロリットルの精液を精子計数チャンバーに追加し、精子クラス分析装置でスライドをスキャンします。少なくとも6つの領域と400の精子を数えて、精子の濃度を推定します。
精子のアポトーシスを検出するには、アネキシン-5 FITC PI染色を使用して、6番目の精子細胞に10個を1.5ミリリットルの遠心チューブに加えます。細胞を500マイクロリットルの冷たいPBSで洗浄します。次に、精子細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨ててから、細胞を200マイクロリットルの結合緩衝液に再懸濁します。
次に、2マイクロリットルのFITCアネキシン-5と2マイクロリットルのPIを添加する。細胞を穏やかにボルテックスし、室温で暗所で15分間インキュベートしてから、フローサイトメーターに入れて分析します。JC-1プローブを用いたミトコンドリア膜電位(MMP)の解析では、6番目の精子細胞に10倍の2個を1.5ミリリットルのチューブに入れ、遠心分離します。遠心分離後、精子細胞懸濁液を1ミリリットルのJC-1ワーキング溶液に再懸濁します。
細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で摂氏37度で20分間インキュベートします。再び、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄し、1ミリリットルのPBSでペレットを2回洗浄する。次に、染色した精子細胞をフローサイトメーターチューブ内の1ミリリットルのPBSに再懸濁し、すぐにチューブをフローサイトメーターに入れて分析します。
次に、カルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)をポジティブコントロールとして使用します。精子細胞を1ミリリットルのCCCPワーキング溶液に再懸濁し、穏やかにボルテックスしてから室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄し、示したようにJC-1プローブを用いてMMPを分析するステップを実行します。
精子クロマチン構造アッセイ(SCSA)の場合、精液サンプルを摂氏37度の水浴で解凍し、TNEバッファーで1〜2倍の濃度に希釈し、1ミリリットルあたり6番目の細胞にします。次に、200マイクロリットルの希釈したサンプルをフローサイトメーターの試験管に加え、400マイクロリットルの酸溶液と混合します。サンプルを1.2ミリリットルのアクリジンオレンジ溶液で染色します。
リファレンスサンプルを内部標準として使用して、フローサイトメーターのセットアップとキャリブレーションを行います。サンプルを摂氏4度のTNEバッファーで希釈し、1ミリリットルあたり6番目の細胞の1〜2倍の濃度に希釈し、示されているようにSCSAの手順を実行します。フローサイトメーターソフトウェアを開き、サイトメーターを起動します。
サンプルデータを収集するには、コントロールサンプルをフローサイトメーターにロードし、Runをクリックしてデータ収集を開始します。データを表示するためのドットプロットを作成します。XY軸のパラメータを選択し、線形を表示してデータを指定します。
次に、多角形ゲートを選択して適用し、分析用の精子集団を描写します。精子のアポトーシスの場合は、FL1をX軸、FL2をY軸に設定します。次に、生きているアポトーシス細胞または壊死細胞を分離するには、象限ゲートをタップしてドラッグし、精子集団を4つの特定の集団にサブセット化します。
MMPの場合、FL1をX軸、FL2をY軸に設定します。次に、多角形ゲートを作成して、精子の集団を 2 つの特定の集団にサブセット化します。SCSAの場合、FL4をX軸、FL1をY軸に設定します。
ゲートを描画し、45度の角度を設定して、細胞の破片信号を排除します。精子のアポトーシス、MMPおよびSCSAの分析のための各サンプルのための10、000の精子の細胞を計算して下さい、残骸および騒音を除去するために細胞数および境界によってデータ収集、流路率の収集を停止する時を示すために操業限界を、置きます。これらの設定をすべてのサンプルに適用します。
必要に応じて、色補正を設定して蛍光の漏れ込みを補正します。サンプルをフローサイトメーターにロードする前に、サンプルを静かにピペットに戻します。次に、サンプル名を入力し、「実行」をクリックします。
実行が完了したら、さらに分析するためにファイル名を指定して、サンプル データを FCS ファイルとして保存します。アネキシン-5 FITC PI染色を用いた精子アポトーシスの測定をここに示します。この分析には、補償と象限を設定するための未染色の精子細胞のネガティブコントロールが含まれていました。
精子のアポトーシスを有するサンプルにおいて、結果は、生存可能または生の早期アポトーシスまたはアポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞および壊死細胞の割合として表された。MMPが高い精子と低い精子亜集団がここに示されています。良質の精液サンプルは、高いオレンジ色と低い緑色の蛍光を示しました。
逆に、質の悪い精液サンプルでは、オレンジ色が低く、緑色の蛍光が高かった。妊娠可能および不妊の男性のSCSA細胞図がここに示されています。精子細胞集団は、高いDNA安定性、DNA断片化指数、および細胞破片を有する正常な細胞集団として同定された。
精液サンプルは摂氏37度でインキュベートし、最大1時間完全に液化する必要があります。
