Bu teknik, uzun bekleme sürelerinin neden olduğu deney kalitesinden önemli ölçüde ödün vermeden akış sitometrisi ile çoklu insan spermatozoa fonksiyonel biyobelirteçlerini tahmin etmek için pratik bir yaklaşım sunar. Bu teknik, infertilite tanısı ve hem tezgahta hem de yatakta sperm fonksiyonunun değerlendirilmesi için pratik ve güvenilir bir araç seti olabilir ve rutin sperm muayenesini tamamlayabilir. Bu prosedür Accuri C6 platformu ile gerçekleştirilir ve küçük değişikliklerle diğer ticari platformlara uygulanabilir.
Başlamak için, semen örneğini 37 santigrat derecede inkübe edin ve örneği bir saat boyunca tamamen sıvılaştırın. Sperm hücrelerini saymak için, sıvılaştırılmış semen örneğini iyice karıştırın, ardından bir sperm sayma odasına 10 mikrolitre meni ekleyin ve slaydı bir sperm sınıfı analizöründe tarayın. Sperm konsantrasyonunu tahmin etmek için en az altı alan ve 400 spermatozoa sayın.
Sperm apoptozunun tespiti için, annexin-5 FITC PI boyaması kullanılarak, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne altıncı sperm hücresine 10 ekleyin. Hücreleri 500 mikrolitre soğuk PBS ile yıkayın. Daha sonra, sperm hücresi süspansiyonunu santrifüjleyin ve hücreleri 200 mikrolitre bağlayıcı tamponda yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın.
Daha sonra, iki mikrolitre FITC annexin-5 ve iki mikrolitre PI ekleyin. Hücreleri nazikçe girdap haline getirin ve analiz için akış sitometresine yerleştirmeden önce karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. JC-1 probu kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin veya MMP'nin analizi için, 1.5 mililitrelik bir tüpe ve santrifüje altıncı sperm hücresine iki kez 10 ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, sperm hücresi süspansiyonunu bir mililitre JC-1 çalışma solüsyonunda tekrar süspanse edin.
Hücreleri nazikçe girdap haline getirin ve karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Yine, süspansiyonu santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, boyanmış sperm hücrelerini bir mililitre PBS'de bir akış sitometresi tüpünde tekrar süspanse edin ve tüpü analiz için hemen akış sitometresine yerleştirin.
Ardından, pozitif kontrol olarak Karbonil Siyanür m-Klorofenilhidrazon veya CCCP kullanın. Sperm hücrelerini bir mililitre CCCP çalışma solüsyonunda tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe etmeden önce hafifçe girdap yapın. İnkübasyondan sonra, süspansiyonu santrifüjleyin, süpernatanı atın ve gösterildiği gibi JC-1 probunu kullanarak MMP'yi analiz etme adımlarını gerçekleştirin.
Sperm kromatin yapısı testi veya SCSA için, semen örneğini 37 santigrat derece su banyosunda çözün ve TNE Tamponu ile mililitre başına bir ila iki kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra, seyreltilmiş numunenin 200 mikrolitresini bir akış sitometresi test tüpüne ekleyin ve 400 mikrolitre asit çözeltisi ile karıştırın. Numuneyi 1.2 mililitre akridin portakal çözeltisi ile boyayın.
Akış sitometresi kurulumu ve kalibrasyonları için dahili standart olarak bir referans numunesi kullanın. Numuneyi dört santigrat derece TNE Tamponu ile mililitre başına bir ila iki kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna seyreltin ve gösterildiği gibi SCSA adımlarını gerçekleştirin. Akış sitometresi yazılımını açın ve sitometreyi başlatın.
Örnek verileri toplamak için akış sitometresine bir kontrol örneği yükleyin ve veri toplamayı başlatmak için Çalıştır'a tıklayın. Verileri görüntülemek için nokta grafikleri oluşturun. XY ekseni parametrelerini seçin ve verileri belirtmek için doğrusal görüntüleyin.
Ardından, analiz için sperm popülasyonunu tanımlamak için çokgen bir kapı seçin ve uygulayın. Sperm apoptozu için FL1'i X ekseni ve FL2'yi Y ekseni olarak ayarlayın. Ardından, canlı apoptotik veya nekrotik hücreleri izole etmek için, sperm popülasyonlarını dört spesifik popülasyona indirmek için kadran kapısına dokunun ve sürükleyin.
MMP için, FL1'i X ekseni ve FL2'yi Y ekseni olarak ayarlayın. Ardından, sperm popülasyonlarını iki spesifik popülasyona indirgemek için çokgen bir kapı oluşturun. SCSA için, FL4'ü X ekseni ve FL1'i Y ekseni olarak ayarlayın.
Kapıyı çizin, hücresel enkaz sinyallerini dışlamak için 45 derecelik bir açı ayarlayın. Sperm apoptozu, MMP ve SCSA analizleri için her numune için 10.000 sperm hücresi hesaplayın, enkaz ve gürültüyü ortadan kaldırmak için hücre sayılarına ve eşiğe bağlı olarak veri toplamanın ne zaman durdurulacağını, akışkan oranını belirtmek için bir çalışma sınırı belirleyin. Bu ayarları tüm örnekler için uygulayın.
Gerekirse, floresan yayılmasını düzeltmek için renk telafisini ayarlayın. Numuneyi akış sitometresine yüklemeden önce yavaşça geri pipetleyin. Ardından, örnek adını girin ve Çalıştır'a tıklayın.
Çalıştırma tamamlandıktan sonra, daha fazla analiz için bir dosya adı vererek örnek verileri FCS dosyası olarak kaydedin. Annexin-five FITC PI boyaması kullanılarak sperm apoptozunun ölçümü burada gösterilmiştir. Bu analiz, kompanzasyon ve kadranları ayarlamak için boyanmamış sperm hücrelerinin negatif kontrolünü içeriyordu.
Sperm apoptozisli bir örnekte sonuçlar, canlı veya canlı erken apoptotik veya apoptotik, geç apoptotik ve nekrotik hücrelerin yüzdeleri olarak ifade edildi. MMP'si yüksek ve düşük olan sperm alt popülasyonu burada gösterilmektedir. Kaliteli bir semen örneği yüksek turuncu ve düşük yeşil floresan gösterdi.
Tersine, düşük kaliteli bir semen örneği düşük turuncu ve yüksek yeşil floresan gösterdi. Doğurgan ve infertil bir erkeğin SCSA sitogramları burada gösterilmektedir. Sperm hücresi popülasyonu, yüksek DNA stabilitesi, DNA fragmantasyon indeksi ve hücre kalıntıları ile normal olarak tanımlandı.
Semen örneği 37 santigrat derecede inkübe edilmeli ve bir saate kadar tamamen sıvılaştırılmalıdır.
