טכניקה זו מציגה גישה מעשית להערכת סמנים ביולוגיים פונקציונליים מרובים של זרעונים אנושיים על ידי ציטומטריית זרימה ללא פשרה משמעותית באיכות הניסוי הנגרמת על ידי זמני המתנה ממושכים. טכניקה זו יכולה להיות ארגז כלים מעשי ואמין לאבחון אי פוריות והערכת תפקוד הזרע הן בספסל והן במיטה, ולהשלים את בדיקת הזרע השגרתית. הליך זה מתבצע עם פלטפורמת Accuri C6 והוא יכול להיות מיושם על פלטפורמות מסחריות אחרות עם שינויים קלים.
כדי להתחיל, לדגור את דגימת הזרע ב 37 מעלות צלזיוס לחלוטין לנזול את הדגימה במשך שעה אחת. כדי לספור את תאי הזרע, ערבבו היטב את דגימת הזרע הנוזלי, ואז הוסיפו 10 מיקרוליטר זרע לתא ספירת זרע וסרקו את השקופית במנתח מחלקת זרע. ספרו לפחות שישה אזורים ו-400 זרעונים כדי להעריך את ריכוז הזרע.
לגילוי אפופטוזיס זרע, באמצעות צביעת ANNEXIN-5 FITC PI, יש להוסיף 10 לתאי הזרע השישיים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לשטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר של PBS קר. לאחר מכן, צנטריפוגו את תרחיף תאי הזרע והשליכו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ קשירה.
לאחר מכן, להוסיף שני מיקרוליטר של FITC annexin-5 ושני מיקרוליטר של PI. מערבלים בעדינות את התאים ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך לפני שמניחים אותם בציטומטר הזרימה לניתוח. לניתוח פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, או MMP, באמצעות בדיקת JC-1, יש להוסיף פי שניים 10 לתאי הזרע השישיים לצינור 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, השהה מחדש את תרחיף תאי הזרע בתמיסת עבודה JC-1 של מיליליטר אחד.
מערבלים בעדינות את התאים ודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך. שוב, צנטריפוגו את המתלים, השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, השהה מחדש את תאי הזרע הצבועים במיליליטר אחד של PBS בצינור ציטומטר זרימה, ומיד מקם את הצינור בציטומטר הזרימה לניתוח.
לאחר מכן, השתמש Carbonyl ציאניד m-Chlorophenylhydrazone, או CCCP כבקרה חיובית. השהה מחדש את תאי הזרע במיליליטר אחד של תמיסת עבודה CCCP ומערבל בעדינות לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את המתלים, השליכו את הסופרנטנט, ובצעו את השלבים לניתוח MMP באמצעות הגשושית JC-1 כפי שהודגמה.
לבדיקת מבנה כרומטין זרע, או SCSA, יש להפשיר את דגימת הזרע באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולדלל עם TNE Buffer לריכוז של אחד עד שניים פי 10 עד התאים השישיים למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 200 מיקרוליטר של הדגימה מדולל למבחנה ציטומטר זרימה ולערבב אותו עם 400 מיקרוליטר של תמיסת חומצה. מכתימים את המדגם עם 1.2 מיליליטר של תמיסת תפוז אקרידין.
השתמש בדוגמת ייחוס כתקן פנימי להגדרה וכיול של ציטומטר זרימה. לדלל את הדגימה עם ארבע מעלות צלזיוס TNE Buffer לריכוז של אחד עד שניים כפול 10 עד התאים השישי למיליליטר, ולבצע את השלבים עבור SCSA, כפי שהודגם. פתח את תוכנת ציטומטר הזרימה והפעל את הציטומטר.
כדי לאסוף נתונים לדוגמה, טען דגימת בקרה על ציטומטר הזרימה ולחץ על הפעל כדי להתחיל באיסוף הנתונים. צור תרשימי נקודות להצגת נתונים. בחר בפרמטרים של ציר XY והצג ליניארי כדי לציין נתונים.
לאחר מכן, בחר והחל שער מצולע כדי לסמן את אוכלוסיית הזרע לניתוח. עבור אפופטוזיס זרע, הגדר את FL1 כציר X ואת FL2 כציר Y. לאחר מכן, כדי לבודד את התאים האפופטוטיים או הנמקיים החיים, הקש וגרור את השער הרביע כדי להקטין את אוכלוסיות הזרע לארבע אוכלוסיות ספציפיות.
עבור MMP, הגדר את FL1 כציר X ואת FL2 כציר Y. לאחר מכן, צרו שער מצולע כדי להקטין את אוכלוסיות הזרע לשתי אוכלוסיות ספציפיות. עבור SCSA, הגדר את FL4 כציר X ואת FL1 כציר Y.
צייר את השער, הגדר זווית של 45 מעלות כדי לא לכלול אותות פסולת סלולרית. חשב 10, 000 תאי זרע עבור כל דגימה עבור אפופטוזיס זרע, MMP וניתוח SCSA, להגדיר מגבלת ריצה כדי לציין מתי להפסיק לאסוף נתונים, קצב פלואידיקה, בהתאם למספרי התאים וסף כדי למנוע פסולת ורעש. החל הגדרות אלה על כל הדגימות.
במידת הצורך, הגדר את פיצוי הצבע כדי לתקן זליגה פלואורסצנטית. החזירו בעדינות את הפיפטה לדגימה לפני שאתם מעמיסים אותה על ציטומטר הזרימה. לאחר מכן, הזן את שם הדוגמה ולחץ על הפעל.
לאחר השלמת ההפעלה, שמור את הנתונים לדוגמה כקובץ FCS על ידי מתן שם קובץ לניתוח נוסף. מדידת אפופטוזיס זרע באמצעות צביעת FITC PI נספח-חמש מוצגת כאן. ניתוח זה כלל בקרה שלילית של תאי זרע לא מוכתמים כדי לקבוע פיצוי ורבעים.
בדגימה עם אפופטוזיס זרע, התוצאות באו לידי ביטוי כאחוזים של תאים אפופטוטיים או אפופטוטיים מוקדמים או חיים, אפופטוטיים מאוחרים ונמק. תת-אוכלוסיית הזרע עם MMP גבוה ונמוך מוצגת כאן. דגימת זרע באיכות טובה הראתה פלואורסצנטיות כתומה גבוהה וירוקה נמוכה.
לעומת זאת, דגימת זרע באיכות ירודה הדגימה פלואורסצנטיות כתומה נמוכה וירוקה גבוהה. ציטוטגרמות SCSA מאדם פורה ועקר מוצגות כאן. אוכלוסיית תאי הזרע זוהתה כנורמלית עם יציבות DNA גבוהה, אינדקס פיצול DNA ופסולת תאים.
דגימת הזרע חייבת להיות מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס ונוזלית לחלוטין עד שעה.
