Questa tecnica presenta un approccio pratico per stimare più biomarcatori funzionali di spermatozoi umani mediante citometria a flusso senza compromettere sostanzialmente la qualità dell'esperimento indotta da tempi di attesa prolungati. Questa tecnica può essere un kit di strumenti pratico e affidabile per la diagnosi di infertilità e la valutazione della funzione degli spermatozoi sia al banco che a letto, e completare l'esame di routine dello sperma. Questa procedura viene eseguita con la piattaforma Accuri C6 e potrebbe essere applicata ad altre piattaforme commerciali con piccole modifiche.
Per iniziare, incubare il campione di sperma a 37 gradi Celsius e liquefare completamente il campione per un'ora. Per contare gli spermatozoi, mescolare accuratamente il campione di sperma liquefatto, quindi aggiungere 10 microlitri di sperma in una camera di conteggio degli spermatozoi e scansionare il vetrino in un analizzatore di classe di spermatozoi. Conta almeno sei aree e 400 spermatozoi per stimare la concentrazione di spermatozoi.
Per il rilevamento dell'apoptosi spermatica, utilizzando la colorazione FITC PI con annessina-5, aggiungere 10 al sesto spermatozoo in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Lavare le celle con 500 microlitri di PBS freddo. Quindi, centrifugare la sospensione delle cellule spermatiche e scartare il surnatante prima di risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone di legame.
Successivamente, aggiungere due microlitri di annessina-5 FITC e due microlitri di PI. Vorticare delicatamente le cellule e incubarle per 15 minuti a temperatura ambiente al buio prima di inserirle nel citometro a flusso per l'analisi. Per l'analisi del potenziale di membrana mitocondriale, o MMP, utilizzando la sonda JC-1, aggiungere due volte 10 al sesto spermatozoo in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare. Dopo la centrifugazione, risospendere la sospensione degli spermatozoi in una soluzione di lavoro JC-1 da un millilitro.
Fate vorticare delicatamente le cellule e incubate per 20 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione, scartare il surnatante e lavare il pellet due volte con un millilitro di PBS. Quindi, sospendere nuovamente gli spermatozoi colorati in un millilitro di PBS in una provetta del citometro a flusso e posizionare immediatamente la provetta nel citometro a flusso per l'analisi.
Successivamente, utilizzare il cianuro di carbonile m-clorofenilidrazone o CCCP come controllo positivo. Risospendere gli spermatozoi in un millilitro di soluzione di lavoro CCCP e vorticare delicatamente prima di incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione, scartare il surnatante ed eseguire i passaggi per analizzare MMP utilizzando la sonda JC-1 come dimostrato.
Per il saggio della struttura della cromatina spermatica, o SCSA, scongelare il campione di sperma a un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e diluirlo con tampone TNE a una concentrazione da una a due volte 10 al sesto cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere 200 microlitri del campione diluito a una provetta per citometro a flusso e mescolarlo con 400 microlitri di soluzione acida. Colorare il campione con 1,2 millilitri di soluzione di arancia acridina.
Utilizzare un campione di riferimento come standard interno per la configurazione e le calibrazioni del citometro a flusso. Diluire il campione con un tampone TNE a quattro gradi Celsius a una concentrazione da una a due volte 10 fino alla sesta cellula per millilitro ed eseguire i passaggi per SCSA, come dimostrato. Aprire il software del citometro a flusso e avviare il citometro.
Per raccogliere i dati del campione, caricare un campione di controllo sul citometro a flusso e fare clic su Esegui per avviare la raccolta dei dati. Creare grafici a punti per la visualizzazione dei dati. Selezionare i parametri dell'asse XY e visualizzare lineare per specificare i dati.
Quindi, selezionare e applicare un cancello poligonale per delineare la popolazione di spermatozoi per l'analisi. Per l'apoptosi degli spermatozoi, impostare FL1 come asse X e FL2 come asse Y. Quindi, per isolare le cellule apoptotiche o necrotiche vive, tocca e trascina il cancello del quadrante per suddividere le popolazioni di spermatozoi in quattro popolazioni specifiche.
Per MMP, impostare FL1 come asse X e FL2 come asse Y. Quindi, crea un cancello poligonale per suddividere le popolazioni di spermatozoi in due popolazioni specifiche. Per SCSA, impostare FL4 come asse X e FL1 come asse Y.
Disegna il cancello, imposta un angolo di 45 gradi per escludere i segnali di detriti cellulari. Calcola 10.000 spermatozoi per ogni campione per l'apoptosi spermatica, le analisi MMP e SCSA, imposta un limite di esecuzione per indicare quando interrompere la raccolta dei dati, la velocità fluidica, a seconda del numero di cellule e della soglia per eliminare detriti e rumore. Applicare queste impostazioni a tutti i campioni.
Se necessario, impostare la compensazione del colore per correggere la fuoriuscita della fluorescenza. Pipettare delicatamente il campione prima di caricarlo sul citometro a flusso. Immettere quindi il nome dell'esempio e fare clic su Esegui.
Una volta completata l'esecuzione, salvare i dati di esempio come file FCS specificando un nome file per un'ulteriore analisi. La misurazione dell'apoptosi spermatica mediante colorazione FITC PI con annessina-cinque è mostrata qui. Questa analisi includeva il controllo negativo degli spermatozoi non colorati per impostare la compensazione e i quadranti.
In un campione con apoptosi spermatica, i risultati sono stati espressi come percentuali di cellule apoptotiche precoci vitali o vive apoptotiche, apoptotiche tardive e necrotiche. La sottopopolazione di spermatozoi con MMP alta e bassa è mostrata qui. Un campione di sperma di buona qualità ha mostrato un'elevata fluorescenza arancione e una bassa fluorescenza verde.
Al contrario, un campione di sperma di scarsa qualità ha dimostrato una bassa fluorescenza arancione e un'alta fluorescenza verde. I citogrammi SCSA di un uomo fertile e infertile sono mostrati qui. La popolazione di spermatozoi è stata identificata come normale con elevata stabilità del DNA, indice di frammentazione del DNA e detriti cellulari.
Il campione di sperma deve essere incubato a 37 gradi Celsius e completamente liquefatto per un massimo di un'ora.
