Этот метод представляет собой практический подход к оценке множественных функциональных биомаркеров сперматозоидов человека методом проточной цитометрии без существенного ущерба для качества эксперимента, вызванного длительным временем ожидания. Этот метод может быть практичным и надежным инструментарием для диагностики бесплодия и оценки функции сперматозоидов как на лабораторном, так и на постельном лечении, а также дополнять рутинное обследование сперматозоидов. Эта процедура выполняется на платформе Accuri C6 и может быть применена к другим коммерческим платформам с незначительными изменениями.
Для начала инкубируйте образец спермы при температуре 37 градусов Цельсия и полностью разжижайте образец в течение одного часа. Чтобы подсчитать сперматозоиды, тщательно перемешайте жидкий образец спермы, затем добавьте 10 микролитров спермы в камеру для подсчета сперматозоидов и отсканируйте предметное стекло в анализаторе класса спермы. Подсчитайте не менее шести участков и 400 сперматозоидов, чтобы оценить концентрацию сперматозоидов.
Для выявления апоптоза сперматозоидов с помощью окрашивания аннексин-5 FITC PI добавляют от 10 до шестых сперматозоидов в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Промойте клетки 500 микролитрами холодного ПБС. Затем центрифугируют суспензию сперматозоидов и отбрасывают надосадочную жидкость перед повторным суспендированием клеток в 200 микролитрах связывающего буфера.
Далее добавляют два микролитра FITC аннексина-5 и два микролитра ПИ. Осторожно вмешайте клетки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте, прежде чем поместить их в проточный цитометр для анализа. Для анализа мембранного потенциала митохондрий, или ММП, с помощью зонда JC-1 добавьте два раза по 10 к шестым сперматозоидам в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугу. После центрифугирования повторно суспендировать суспензию сперматозоидов в рабочем растворе JC-1 объемом один миллилитр.
Аккуратно встряхните клетки и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Снова центрифугируйте суспензию, выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте гранулу одним миллилитром PBS. Затем повторно суспендируйте окрашенные сперматозоиды в одном миллилитре PBS в проточной цитометрической пробирке и сразу же поместите пробирку в проточный цитометр для анализа.
Затем используйте карбонильцианид м-хлорфенилгидразон, или CCCP, в качестве положительного контроля. Повторно суспендируйте сперматозоиды в одном миллилитре рабочего раствора CCCP и осторожно взбейте перед инкубацией при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубации центрифугируйте суспензию, выбросьте надосадочную жидкость и выполните шаги по анализу MMP с помощью зонда JC-1, как показано на рисунке.
Для анализа структуры хроматина сперматозоидов, или SCSA, разморозьте образец спермы на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия и разбавьте буфером TNE до концентрации один-два раза по 10 до шестых клеток на миллилитр. Далее в пробирку пробирки проточного цитометра добавляют 200 микролитров разбавленного образца и смешивают его с 400 микролитрами раствора кислоты. Окрасьте образец 1,2 миллилитрами раствора акридинового апельсина.
Используйте эталонный образец в качестве внутреннего эталона для настройки и калибровки проточного цитометра. Разбавьте образец буфером TNE Buffer на четыре градуса Цельсия до концентрации один-два раза по 10 до шестых клеток на миллилитр и выполните шаги для SCSA, как показано на рисунке. Откройте программное обеспечение проточного цитометра и запустите цитометр.
Чтобы собрать данные пробы, загрузите контрольный образец в проточный цитометр и нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать сбор данных. Создание точечных диаграмм для просмотра данных. Выберите параметры оси XY и отобразите линейные данные, чтобы указать данные.
Затем выберите и примените полигональные ворота, чтобы очертить популяцию сперматозоидов для анализа. Для апоптоза сперматозоидов установите FL1 в качестве оси X и FL2 в качестве оси Y. Затем, чтобы изолировать живые апоптотические или некротические клетки, нажмите и перетащите ворота квадранта, чтобы свести популяции сперматозоидов к четырем конкретным популяциям.
Для MMP установите FL1 в качестве оси X и FL2 в качестве оси Y. Затем создайте полигональные ворота, чтобы свести популяции сперматозоидов к двум конкретным популяциям. Для SCSA установите FL4 в качестве оси X, а FL1 в качестве оси Y.
Нарисуйте ворота, установите угол 45 градусов, чтобы исключить сигналы клеточного мусора. Рассчитать 10 000 сперматозоидов для каждого образца для апоптоза сперматозоидов, анализов MMP и SCSA, установить предел выполнения, чтобы указать, когда прекратить сбор данных, скорость флюидики в зависимости от количества клеток и порог для устранения мусора и шума. Примените эти параметры ко всем образцам.
При необходимости установите цветовую компенсацию для коррекции флуоресцентного перелива. Осторожно отпипетьте образец перед загрузкой в проточный цитометр. Затем введите имя образца и нажмите кнопку Выполнить.
После завершения выполнения сохраните данные образца в виде файла FCS, указав имя файла для дальнейшего анализа. Здесь показано измерение апоптоза сперматозоидов с помощью окрашивания FITC PI. Этот анализ включал отрицательный контроль неокрашенных сперматозоидов для установки компенсации и квадрантов.
В образце с апоптозом сперматозоидов результаты выражались в процентном соотношении жизнеспособных или живых ранних апоптотических или апоптотических, поздних апоптотических и некротических клеток. Здесь показана субпопуляция сперматозоидов с высоким и низким ММР. Образец спермы хорошего качества показал высокую оранжевую и низкую зеленую флуоресценцию.
И наоборот, образец спермы низкого качества демонстрировал низкую оранжевую и высокую зеленую флуоресценцию. Здесь показаны цитограммы SCSA фертильного и бесплодного мужчины. Популяция сперматозоидов была идентифицирована как нормальная с высокой стабильностью ДНК, индексом фрагментации ДНК и клеточным мусором.
Образец спермы должен быть инкубирован при температуре 37 градусов Цельсия и полностью сжижен в течение одного часа.
