هذا البروتوكول هو نهج مفيد لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض ويمكن أن يساعد في مزيد من البحوث في توزيع مسببات الأمراض المتعلقة بالبعوض ومكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض. يعد استخدام خطوط رفيعة لعزل الفيروسات في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 أكثر أمانا وكفاءة. على عكس إجراءات عزل الفيروسات الأخرى ، مثل التلقيح الأحمر بالدراجة بسائل متغير ، لا تتطلب هذه التقنية إجراء تجارب على الحيوانات أو تقييم أخلاقي.
يمكن أن يؤدي التلوث من العينات والخلايا التي يتم سحبها أثناء الحضانة إلى فشل التجربة. وبالتالي ، من الضروري إضافة 2٪ بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين إلى الوسط لمنع التلوث. ابدأ بإضافة حبات خزفية بثلاثة ملليمترات ، 1.5 ملليلتر من وسط RPMI مكمل بمحلول 2٪ بنسلين-ستربتومايسين-أمفوتريسين ب في أنبوب معقم سعة 2 مليلتر يوضع على الجليد ثم انقل 50 بعوضة فيه.
بعد ذلك ، قم بتجانس البعوض باستخدام خالط الأنسجة بدرجة حرارة منخفضة عن طريق الطحن لمدة 30 ثانية عند 70 هرتز و 4 درجات مئوية لمدة 3 دورات. أجهزة الطرد المركزي المجانسة عند 15،000 G لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المواد الطافية إلى الأنابيب الجديدة. لإزالة حطام البعوض تماما ، قم بطرد الجهاز الطافي مرة أخرى عند 15،000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
قم بقسمة 200 ميكرولتر من المادة الطافية P0 في أنبوب تخزين بغطاء لولبي سعة 2 ملليلتر ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتضخيم الفيروس ، استخدم خط خلايا البعوض Aedes albopictus RNAi الذي يعاني من نقص C6 / 36 وخط خلايا الفقاريات أو كلية الهامستر الصغيرة أو BHK-21 من قارورة مربعة طولها 75 سم وقم بزرعها في 24 لوحة بئر بشكل منفصل. ضع صفيحة البئر المصنفة 24 طوال الليل عند 28 أو 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر لتأكيد التقاء 80 إلى 90٪ في كل بئر. تحضير 500 ملليلتر من وسط صيانة زراعة الخلايا تستكمل بالمضادات الحيوية. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من 24 لوحة بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسيط صيانة زراعة الخلايا إلى كل بئر.
ثم تلقيح الخلايا مع 100 ميكرولتر من طاف البعوض المجانس أو P0. احتضن الألواح عند 28 أو 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة وهز الألواح برفق بعد كل 15 دقيقة لمنع جفاف الخلايا. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وشطف كل بئر ب 600 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا لإزالة الحطام تماما. بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر من وسط صيانة زراعة الخلايا إلى كل بئر قبل وضع الألواح في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 28 أو 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
مراقبة يومية لحالة خلايا كل بئر تحت المجهر. في اليوم السابع ، اجمع طاف الخلايا المعروف باسم P1 وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. كرر الإجراء لجمع الطافات الفيروسية P2 و P3.
بسبب التأثير الممرض الخلوي ، أو CPE ، تموت الخلايا من بعض الآبار وتنفصل عن السطح. لتضخيم الفيروسات بشكل كبير ، اجمع 300 إلى 400 ميكرولتر من المادة الطافية من الآبار التي تظهر تأثير CPE وانقلها إلى صفيحة جديدة من ستة آبار تحتوي على 80 إلى 90٪ من خلايا التقاء خلايا الثقافة. أخيرا ، قم بجمع ونقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية من آبار الصفيحة ذات الستة آبار إلى أنابيب تخزين ذات غطاء لولبي سعة 2 مليلتر قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
أظهر تلقيح خلايا C6 / 36 بمتجانسات البعوض P0 مساحة واسعة بين الخلايا في الخلايا المقشرة في فترة 120 ساعة بعد الإصابة مقارنة بالخلايا غير الملقحة أو الضابطة. أظهرت حضانة خلايا BHK21 مع الطافات الفيروسية P3 CPE مرئية في 48 ساعة بعد الإصابة ، مما يدل على موت الخلية والانفصال عن السطح على عكس الخلايا الضابطة. تم استخدام الاشعال العالمية المتاحة تجاريا أو Flaviviruses و Alphaviruses و Bunyaviruses لتوليد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للطاف الفيروسي.
تم تعيين منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لفيروس بونيا ، فيروس بحيرة إبينور ، كعنصر تحكم إيجابي. وسلط حظر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الممرات التابعة لفيروسات بونيا والمراقبة الإيجابية الضوء على إمكانية وجود فيروس بونيا في المواد الطافية. لتحسين معدل نجاح عزل الفيروس ، حافظ على درجة حرارة منخفضة أثناء نقل العينات وعزلها وطحنها.
أضف المضادات الحيوية عند تجانس البعوض والثقافة نفسها. والتعامل مع الثقافة بسرعة أثناء الحضانة وإزالة وسط الاستزراع. بالإضافة إلى هذا الإجراء ، يمكن حقن محلول الطحن في فأر ركوب الدراجات أو جنين الدجاج.
ومع ذلك ، فإن إجراء التأكيد سيثير مخاوف أخلاقية ويزيد من تكلفة التجربة.
