이 프로토콜은 모기 관련 바이러스를 분리하는 데 유용한 접근 방식이며 모기와 관련된 병원체의 분포 및 모기 매개 질병의 통제에 대한 추가 연구에 도움이 될 수 있습니다. 생물 안전 레벨 2 실험실에서 바이러스를 분리하기 위해 가는 선을 사용하는 것이 더 안전하고 효율적입니다. 다양한 액체로 적색 접종을 순환시키는 것과 같은 다른 바이러스 분리 절차와 달리 이 기술은 동물 실험이나 윤리적 평가가 필요하지 않습니다.
배양 중 시료 및 세포 채취로 인한 오염은 실험 실패로 이어질 수 있습니다. 그러므로, 오염을 방지하기 위하여 2%페니실린-스트렙토마이신-암포테리신을 배지에 첨가하는 것이 필요합니다. 얼음 위에 놓인 2 밀리리터 멸균 튜브에 2 % 페니실린-스트렙토 마이신-암포 테리 신 B 용액이 보충 된 RPMI 배지 1.5 밀리리터의 3 밀리미터 세라믹 비드를 첨가 한 다음 50 마리의 모기를 옮깁니다.
다음으로, 모기를 저온 조직 균질기로 70헤르츠, 섭씨 4도에서 3사이클 동안 30초 동안 분쇄하여 균질화한다. 섭씨 4도에서 30 분 동안 15, 000 G에서 균질 액을 원심 분리하고 상청액을 새로운 튜브로 옮깁니다. 모기 파편을 완전히 제거하려면 섭씨 4도에서 10 분 동안 15, 000G에서 상청액을 다시 원심 분리하십시오.
200마이크로리터의 상등액 P0을 2밀리리터 스크류 캡 저장 튜브에 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 바이러스 증폭을 위해 Aedes albopictus RNAi 결핍 모기 세포주 C6/36과 척추동물 세포주, 베이비 햄스터 신장 또는 BHK-21을 75cm 정사각형 플라스크에서 사용하여 24웰 플레이트에 별도로 시드합니다. 시드된 24웰 플레이트를 섭씨 28도 또는 37도에서 밤새 놓습니다.
다음날, 현미경으로 세포를 관찰하여 각 웰에서 80 내지 90%의 밀도를 확인하였다. 항생제가 보충된 세포 배양 유지 배지 500밀리리터를 준비합니다. 24 웰 플레이트로부터 세포 배양 배지를 제거하고, 100 마이크로리터의 세포 배양 유지 배지를 각 웰에 첨가한다.
그런 다음 모기 균질액 또는 P0의 상청액 100 마이크로 리터로 세포를 접종합니다. 플레이트를 섭씨 28도 또는 37도에서 60분 동안 배양하고 세포의 건조를 방지하기 위해 15분마다 플레이트를 부드럽게 흔든다. 완료되면 상층액을 제거하고 600마이크로리터의 세포 배양 유지 배지로 각 웰을 헹구어 파편을 완전히 제거합니다. 다음으로, 800 마이크로 리터의 세포 배양 유지 배지를 각 웰에 첨가 한 후 플레이트를 섭씨 28도 또는 37 도의 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에 7 일 동안 넣는다.
매일 현미경으로 각 웰의 세포 상태를 모니터링하십시오. 일곱째 날에는 P1으로 알려진 세포의 상층액을 채취하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 절차를 반복하여 P2 및 P3 바이러스 상청액을 수집합니다.
세포 병원성 효과 (CPE)로 인해 일부 우물의 세포가 죽어 표면에서 분리됩니다. 바이러스를 크게 증폭시키기 위해 CPE 효과를 나타내는 웰에서 300 내지 400 마이크로리터의 상청액을 수집하고, 이를 배양 세포의 80 내지 90% 세포 밀도를 갖는 새로운 6-웰 플레이트로 옮긴다. 마지막으로, 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 6웰 플레이트의 웰에서 500마이크로리터의 상청액을 수집하여 2밀리리터 스크류 캡 저장 튜브로 옮깁니다.
모기 균질액 P0로 C6/36 세포를 접종한 결과, 접종되지 않은 세포 또는 대조군 세포에 비해 감염 후 120시간에 박리된 세포에서 넓은 세포간 공간을 나타내었다. P3 바이러스 상청액과 함께 BHK21 세포를 배양한 결과 감염 후 48시간에 가시적인 CPE가 나타났으며, 대조군 세포와 달리 세포의 사멸과 표면으로부터의 박리를 나타냈습니다. 상업적으로 이용가능한 유니버셜 프라이머 또는 플라비바이러스, 알파바이러스 및 부냐바이러스를 바이러스 상청액에 대한 PCR 산물을 생성하는데 사용하였다.
Bunyavirus에 대한 PCR 산물인 Ebinur Lake 바이러스를 양성 대조군으로 설정했습니다. Bunyaviruses에 속하는 레인에서의 PCR 증폭 금지 및 양성 대조군은 상청액에 Bunyavirus가 존재할 가능성을 강조했습니다. 바이러스 분리의 성공률을 높이려면 샘플 운송, 분리 및 분쇄 중에 낮은 온도를 유지하십시오.
모기와 배양 자체를 균질화 할 때 항생제를 추가하십시오. 배양 중에 배양액을 신속하게 처리하고 배양액을 제거한다. 이 절차 외에도, 분쇄 용액은 사이클링 쥐 또는 닭 배아에 주입 될 수있다.
그러나 확인 절차는 윤리적 문제를 제기하고 실험 비용을 증가시킵니다.
