تقوم هذه الطريقة بتصور وتحديد قدرة الخلايا السرطانية على التطهير والغزو ، وبالتالي القدرة على تقييم عدوانيتها النقيلية قبل تكوين العمل أو الانبثاث. أن يعتمد التسجيل على عملية التفكيك كشرط أساسي لتشكيل ورم خبيث ، وبالتالي تحقيق المعلومات المتعلقة بالعدوانية النقيلية للخلايا بطريقة سريعة وسهلة ورخيصة نسبيا. تدرب على الخطوات الفردية المختلفة أولا قبل بدء التجربة الفعلية.
يتضمن فحص CAM-Delam العديد من الخطوات الفنية التي يصعب شرحها كتابيا وأسهل بكثير في التقدير والتعلم من خلال العرض المرئي. لبدء وضع العدد المطلوب من البيض في صواني البيض واحتضان بيض الفرخ أفقيا في حاضنة البيض. ثم قم بتعقيم 30 قاربا يزن و 30 صندوقا بلاستيكيا صغيرا بأغطية شفافة عن طريق رش 70٪ من الإيثانول.
بعد ذلك ، قم بتجفيف قوارب الوزن والصناديق في غطاء ورققي طوال الليل وتخزينها في صندوق بلاستيكي مغلق حتى يتم استخدامها مرة أخرى في يوم الحضانة الثالث. قم بتعقيم لترين من الماء المقطر أو منزوع الأيونات لكل 30 بيضة محتضنة ، وزوجين من المقص ، وثلاثة أزواج من الملقط. أولا ، أضف ما يقرب من 50 ملليلتر من الماء المعقم إلى الصناديق البلاستيكية المعقمة وأغلق الأغطية.
في يوم الحضانة الثالث ، قم بتكسير قشرة البيضة باستخدام الجزء الحاد من المقص وقطع فتحة مستقيمة في القشرة. بعد فتح قشرة البيضة يدويا فوق قارب الوزن ، اجمع بياض البيض وصفار البيض وربطه بجنين سليم في قارب الوزن. ثم ابحث عن جنين سليم بقلب نابض وصفار سليم وأوعية دموية متطورة للتجربة.
بعد ذلك ، انقل قارب الوزن بلطف إلى غرفة داخلية مرطبة واحتضن الغرفة الداخلية المرطبة في حاضنة البيض. لإعداد حلقات السيليكون ، قم بقطع أنبوب سيليكون بقطر داخلي وخارجي يبلغ أربعة ملليمترات وخمسة ملليمترات على التوالي بسماكة ملليمتر واحد تقريبا ، ويفضل استخدام قاطع ورق. ثم انقل حلقات السيليكون إلى زجاجات زجاجية صغيرة.
قم بتغطيتها بورق معدني وتعقيمها باستخدام الأوتوكلاف أو ما شابه ذلك. تخزين حلقات السيليكون المعقمة في درجة حرارة الغرفة. استزرع خطوط الخلايا السرطانية ذات الاهتمام في وسط الثقافة ذي الصلة في زراعة الخلايا.
ثم تحضير ملليلتر واحد من مزيج RPMI الكولاجين والحفاظ عليه على الجليد. بعد ذلك ، قم بالتريبسين الخلايا السرطانية لعزل الخلايا عن طريق إزالة وسط زراعة الخلايا أولا وغسلها. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التربسين لكل طبق زراعة خلية قطره 15 سم واحتضنه لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في حاضنة زراعة الخلايا حتى تنفصل الخلايا.
باستخدام مجهر مقلوب على الطاولة ، انظر الخلايا المنفصلة. ثم قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة خمسة ملليلترات من وسط RPMI الكامل إلى كل طبق من أطباق زراعة الخلايا وجمع تعليق الخلية من جميع أطباق زراعة الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر. لحساب الخلايا السرطانية ، أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى 10 ميكرولترات من 0.4٪ من بقع التربان الزرقاء.
بعد خلط العينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات ، قم بتحميل 10 ميكرولترات من خليط الخلية لكل غرفة في شريحة العينة في عداد الخلية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق زراعة الخلايا ذات الحجم الصحيح في أنبوب 50 ملليلتر عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من السوبرناتانت ، امزج حبيبة الخلية مع ملليلتر واحد من مزيج الكولاجين RPMI.
بمجرد خلط الخلايا مع ماصة ملليلتر واحدة ، حافظ على تعليق الخلية المحضر على الجليد. في يوم الحضانة 10 ، أخرج الغرف الداخلية المرطبة مع البيض المحتضن بدون قشرة من الحاضنة. بعد فتح الغرفة الداخلية المرطبة ، ضع ما يصل إلى ست حلقات سيليكون على CAM باستخدام ملقط معقم.
بمجرد خلط تعليق الخلايا السرطانية عن طريق السحب للحصول على توزيع متساو للخلايا السرطانية ، أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية المحضر داخل حلقة سيليكون. بعد إغلاق الغرفة الرطبة الداخلية ، ضعها في حاضنة البيض. بعد 14 ساعة و 1.5 يوم و 2.5 يوم و 3.5 يوم من الحضانة ، أخرج ما يقرب من سبع غرف داخلية مرطبة أثناء فتح أغطيتها واحدة تلو الأخرى.
باستخدام زوج من المقصات ، قم بتشريح الخلايا السرطانية المستزرعة المرتبطة ب CAM عن طريق القطع خارج حلقة السيليكون. ثم انقل على الفور عينة CAM-Delam المعزولة باستخدام ملقط إلى 4٪ paraformaldehyde في 0.1 مخزن مؤقت للفوسفات المولي في طبق بتري لتثبيت الأنسجة واحتفظ بها على الجليد أو عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد 4٪ وأضف 30٪ من السكروز في مخزن مؤقت للفوسفات المولي 0.1 إلى عينات CAM-Delam وتوازن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة حلقة السيليكون بعناية باستخدام الملقط. بعد ذلك ، قم بقطع عينة CAM-Delam في شكل مستطيل مع الخلايا السرطانية في الوسط باستخدام زوج من المقص. ثم انقل عينات CAM-Delam إلى وسط مقطع مجمد في طبق بتري لإزالة السكروز الزائد ثم إلى تضمين القوالب في وسط المقطع المجمد بزوج من الملقط.
تحت مجهر التشريح ، ضع عينة CAM-Delam على شكل حرف U في تفاعل رأسي في قوالب التضمين باستخدام أي أداة تشبه الإبرة وقم بتخزين عينات CAM-Delam عند 80 درجة مئوية. ثم قسم عينات CAM-Delam المجمدة عند 10 ميكرومتر على خمس إلى ست شرائح متتالية باستخدام التقسيم بالتبريد. أولا ، قم بعمل خط بعلامة مسعورة على الشرائح حيث تنتهي الأقسام واتركها تجف لبضع دقائق.
ثم ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بتغطية الأقسام بحوالي 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول الحجب واحتضنها لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد سكب محلول الحجب ، استبدله ب 100 إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية المخفف في محلول الحجب واحتضنه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. وبالمثل ، بعد صب محلول الأجسام المضادة الأساسي ، انقل الشرائح إلى الكوفيت الزجاجي واغسلها ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.
بعد ذلك ، قم بإزالة TBST الزائد من الشريحة ومن منطقة الحاجز الكارهة للماء بمنديل ورقي ناعم وقم بتغطية الشريحة ب 100 إلى 150 ميكرولتر من جسم مضاد فلورسنت ثانوي مناسب مخفف في محلول مانع مع DAPI. احتضان الشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد سكب محلول الأجسام المضادة الثانوي ، انقل الشرائح إلى الكوفيت الزجاجي واغسلها ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق لكل منها في TBST.
ثم قم بإزالة TBST الزائد من الشريحة ومن منطقة الحاجز الكارهة للماء باستخدام منديل ورقي ناعم. بعد ذلك ، قم بتركيب الشرائح عن طريق وضع قطرة إلى قطرتين من وسط تركيب الفلورسنت على الشريحة ووضع انزلاق غطاء زجاجي برفق مع تجنب فقاعات الهواء. قم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر epifluorescence المجهز بكاميرا رقمية ، ويفضل أن يكون ذلك في تكبير 10 X وتحليل الأقسام باستخدام فئات تسجيل CAM-Delam التالية كما هو موضح في المخطوطة.
أدى استخدام الغرف الرطبة الداخلية إلى تحسين معدل بقاء أجنة الكتاكيت بشكل كبير من أقل من 50٪ إلى 90٪ في يوم الحضانة 10 ومن حوالي 15٪ إلى 80٪ في يوم الحضانة 13. تظهر النتائج أن قدرة الخلايا السرطانية على تحلل الصفيحة القاعدية وغزو اللحمة المتوسطة يمكن تسجيلها في أربع فئات بما في ذلك الصفيحة القاعدية السليمة دون تغييرات مرئية ، والصفيحة القاعدية المعدلة ولكن غير التالفة ، والصفيحة القاعدية التالفة دون غزو الخلايا ، والصفيحة القاعدية التالفة مع غزو الخلايا. يظهر تلطيخ الأجسام المضادة ضد عامل فون ويلبراند أن الطب التكميلي والبديل كان سميكا أيضا مع زيادة في تكوين الأوعية الدموية عندما تسببت الخلايا السرطانية في تغيير أو تلف الصفيحة القاعدية.
ومع ذلك ، لم يلاحظ أي من هذين النمطين الظاهريين عندما كان CAM سليما. استحدثت خلايا PC-3U اللامينين التالف بعد 1.5 يوم مع غزو واضح بعد 2.5 يوم. في المقابل ، تسببت خلايا U251 فقط في حدوث تغييرات طفيفة في اللامينين بعد 1.5 إلى 3.5 أيام ، ولكنها لم تسبب أي ضرر مرئي للأمينين.
بعد علاج كلوريد الكوبالت ، اكتسبت الخلايا السرطانية غير النقيلية U251 القدرة على تحفيز التفكيك والخلايا الغازية ، والتي تم قمعها عند دمجها مع مثبط MMP ، GM6001. عدم إتلاف CAM بطرف الماصة عند بذر الخلايا السرطانية لأن مثل هذا الضرر للغشاء سيدمر قراءات الفحص. الاحتمال المستقبلي هو تحسين طريقة CAM-Delam لتحديد الخصائص النقيلية في عينات الورم السريرية ، والتي يمكن أن تكمل في المستقبل مرحلة ورم خبيث عقدة الورم المستخدمة اليوم.
