El método visualiza y cuantifica la capacidad de las células cancerosas para deslaminarse e invadir, pudiendo así valorar su agresividad metastásica ante la formación de acción o metástasis. Que la puntuación se basa en el proceso de delaminación como requisito previo para la formación de metástasis, logrando así información sobre la agresividad metastásica de las células de una manera relativamente rápida, fácil y barata. Practique los diferentes pasos individuales primero antes de comenzar el experimento real.
El ensayo CAM-Delam incluye varios pasos técnicos que son difíciles de explicar por escrito y mucho más fáciles de apreciar y aprender mediante demostración visual. Para comenzar, coloque el número deseado de huevos en bandejas de huevos e incube los huevos de pollitos horizontalmente en una incubadora de huevos. Luego esterilice 30 botes de pesaje y 30 pequeñas cajas de plástico con tapas transparentes rociando etanol al 70%.
A continuación, seque los botes de pesaje y las cajas en una campana laminar durante la noche y guárdelos en una caja de plástico cerrada hasta su uso posterior en el tercer día de incubación. Esterilizar dos litros de agua destilada o desionizada por cada 30 huevos incubados, dos pares de tijeras y tres pares de fórceps. Primero, agregue aproximadamente 50 mililitros de agua esterilizada a las cajas de plástico esterilizadas y cierre las tapas.
En el tercer día de incubación, rompa la cáscara del huevo con la parte afilada de las tijeras y corte una abertura recta en la cáscara. Después de abrir la cáscara del huevo manualmente sobre un bote de pesaje, recoja la clara de huevo, la yema y se adhiera el embrión sano en el bote de pesaje. Luego busque un embrión intacto con un corazón latiendo, yema intacta y vasos sanguíneos desarrollados para el experimento.
A continuación, transfiera suavemente el bote de pesaje a una cámara humidificada interna e incube la cámara humidificada interna en la incubadora de huevos. Para preparar anillos de silicona, corte un tubo de silicona con un diámetro interno y externo de cuatro milímetros y cinco milímetros respectivamente en aproximadamente un milímetro de grosor, preferiblemente usando un cortador de papel. Luego transfiera los anillos de silicona a pequeñas botellas de vidrio.
Cúbralos con lámina metálica y esterilícelos con un autoclave o similar. Guarde los anillos de silicona estériles a temperatura ambiente. Cultivar las líneas celulares de cáncer de interés en el medio de cultivo relevante en cultivo celular.
Luego prepare un mililitro de mezcla de colágeno RPMI y manténgalo en hielo. A continuación, tripsinizar las células cancerosas para aislar las células mediante la eliminación del medio de cultivo celular y el lavado. Luego agregue tres mililitros de solución de tripsina por plato de cultivo celular de 15 centímetros de diámetro e incube durante dos o tres minutos en una incubadora de cultivo celular hasta que las células se desprendan.
Usando un microscopio invertido de mesa, vea las células separadas. Luego inactive la tripsina agregando cinco mililitros de medio RPMI completo a cada plato de cultivo celular y recoja la suspensión celular de todos los platos de cultivo celular en un tubo de 50 mililitros. Para contar las células cancerosas, agregue 10 microlitros de la suspensión celular a 10 microlitros de tinción azul de tripano al 0.4%.
Después de mezclar la muestra mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo varias veces, cargue 10 microlitros de la mezcla celular por cámara en el portaobjetos de muestra en el contador de celdas. A continuación, centrifugue la suspensión de cultivo celular de volumen correcto en un tubo de 50 mililitros a 500 veces G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, mezcle el pellet celular con un mililitro de la mezcla de colágeno RPMI.
Una vez que las células se mezclen con una pipeta de un mililitro, mantenga la suspensión de la celda preparada en hielo. En el día 10 de incubación, saque las cámaras humidificadas internas con los huevos incubados sin cáscara de la incubadora. Después de abrir la cámara humidificada interna, coloque hasta seis anillos de silicona en el CAM con fórceps esterilizados.
Una vez que la suspensión de células cancerosas se mezcle mediante pipeteo para obtener una distribución uniforme de las células cancerosas, agregue 20 microlitros de la suspensión de células cancerosas preparada dentro de un anillo de silicona. Después de cerrar la cámara humidificada interna, colóquela en la incubadora de huevos. Después de 14 horas, 1.5 días, 2.5 días y 3.5 días de incubación, saque aproximadamente siete cámaras humidificadas internas mientras abre sus párpados uno a la vez.
Con un par de tijeras, diseccione las células cancerosas cultivadas unidas al CAM cortando fuera del anillo de silicona. Luego transfiera inmediatamente la muestra aislada de CAM-Delam usando fórceps al 4% de paraformaldehído en un tampón de fosfato molar 0.1 en una placa de Petri para la fijación del tejido y manténgalo en hielo o a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la solución de paraformaldehído al 4% y agregue el 30% de sacarosa en un tampón de fosfato molar 0.1 a las muestras de CAM-Delam y equilibre a cuatro grados Celsius durante una hora.
Bajo un microscopio de disección, retire cuidadosamente el anillo de silicona con fórceps. A continuación, corte la muestra de CAM-Delam en forma rectangular con las células cancerosas en el medio usando un par de tijeras. Luego transfiera las muestras de CAM-Delam al medio de sección congelado en una placa de Petri para eliminar el exceso de sacarosa y luego a incrustar moldes en medio de sección congelado con un par de pinzas.
Bajo un microscopio de disección, coloque la muestra de CAM-Delam en forma de U en una reacción vertical en los moldes de incrustación utilizando cualquier instrumento similar a una aguja y almacene las muestras de CAM-Delam a 80 grados Celsius. Luego seccione las muestras CONGELADAS de CAM-Delam a 10 micrómetros en cinco a seis diapositivas consecutivas utilizando crioseccionamiento. Primero, haz una línea con un marcador hidrofóbico en las diapositivas donde terminan las secciones y déjalas secar durante unos minutos.
Luego coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y cubra las secciones con aproximadamente 200 a 500 microlitros de solución de bloqueo e incube durante 15 a 30 minutos. Después de verter la solución de bloqueo, reemplácela con 100 a 150 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en la solución de bloqueo e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Del mismo modo, después de verter la solución primaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos tres veces durante cinco minutos cada uno en TBST.
A continuación, retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando y cubra el portaobjetos con 100 a 150 microlitros de un anticuerpo fluorescente secundario adecuado diluido en solución de bloqueo combinada con DAPI. Incubar el tobogán en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Después de verter la solución secundaria de anticuerpos, transfiera los portaobjetos a las cubetas de vidrio y lave al menos tres veces durante cinco minutos cada uno en TBST.
Luego retire el exceso de TBST del portaobjetos y del área de barrera hidrofóbica con un pañuelo de papel blando. A continuación, monte las diapositivas colocando una o dos gotas de medio de montaje fluorescente en la diapositiva y coloque suavemente un deslizamiento de cubierta de vidrio mientras evita las burbujas de aire. Fotografíe las secciones utilizando un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara digital, preferiblemente con un aumento de 10 X y analice las secciones utilizando las siguientes categorías de puntuación CAM-Delam como se describe en el manuscrito.
El uso de cámaras humidificadas internas mejoró significativamente la tasa de supervivencia de los embriones de pollitos de menos del 50% hasta el 90% en el día de incubación 10 y de aproximadamente el 15% hasta el 80% en el día de incubación 13. Los resultados muestran que la capacidad de las células cancerosas para degradar la lámina basal e invadir el mesénquima se puede calificar en cuatro categorías, incluida la lámina basal intacta sin alteraciones visibles, la lámina basal alterada pero no dañada, la lámina basal dañada sin invasión celular y la lámina basal dañada con invasión celular. La tinción de anticuerpos contra el factor de von Willebrand muestra que el CAM también se engrosó con un aumento en la formación de vasos sanguíneos cuando las células cancerosas causaron una lámina basal alterada o dañada.
Sin embargo, ninguno de estos dos fenotipos se observó cuando el CAM estaba intacto. Las células PC-3U indujeron laminina dañada después de 1,5 días con una invasión clara después de 2,5 días. En contraste, las células U251 solo indujeron alteraciones menores de laminina después de 1.5 a 3.5 días, pero nunca causaron ningún daño visible a la laminina.
Después del tratamiento con cloruro de cobalto, las células cancerosas no metastásicas U251 adquirieron la capacidad de inducir delaminación y células invasivas, que se suprimieron cuando se combinaron con el inhibidor de MMP, GM6001. No dañar el CAM con la punta de la pipeta al sembrar las células cancerosas, ya que dicho daño de la membrana destruirá las lecturas del ensayo. Una posibilidad futura es optimizar el método CAM-Delam para determinar las propiedades metastásicas en muestras clínicas de tumores, que podrían complementar en el futuro la estadificación de metástasis de ganglios tumorales utilizada en la actualidad.
