Yöntem, kanser hücrelerinin delaminasyon ve istila etme yeteneğini görselleştirir ve ölçer, böylece etki oluşumu veya metastaz öncesi metastatik saldırganlıklarını değerlendirebilir. Puanlamanın metastaz oluşumu için ön koşul olarak delaminasyon sürecine dayanması, böylece hücrelerin metastatik agresifliği hakkında nispeten hızlı, kolay ve ucuz bir şekilde bilgi elde edilmesi. Gerçek deneye başlamadan önce farklı bireysel adımları uygulayın.
CAM-Delam testi, yazılı olarak açıklanması zor olan ve görsel gösterimle takdir edilmesi ve öğrenilmesi çok daha kolay olan birkaç teknik adım içerir. İstenilen sayıda yumurtayı yumurta tepsilerine yerleştirmeye başlamak ve civciv yumurtalarını bir yumurta inkübatöründe yatay olarak kuluçkaya yatırın. Daha sonra 30 tartım teknesini ve 30 küçük plastik kutuyu şeffaf kapaklı, %70 etanol püskürterek sterilize edin.
Daha sonra, tartım teknelerini ve kutularını laminer bir davlumbazda gece boyunca kurutun ve üçüncü inkübasyon gününde daha fazla kullanana kadar kapalı bir plastik kutuda saklayın. 30 kuluçkalanmış yumurta, iki çift makas ve üç çift forseps başına iki litre damıtılmış veya deiyonize suyu sterilize edin. İlk olarak, sterilize plastik kutulara yaklaşık 50 mililitre sterilize su ekleyin ve kapakları kapatın.
Kuluçka üçüncü gününde, makasın keskin kısmını kullanarak yumurta kabuğunu kırın ve kabukta düz bir açıklık kesin. Yumurta kabuğunu bir tartım teknesinin üzerinde manuel olarak açtıktan sonra, yumurta akını, yumurta sarısını toplayın ve tartım teknesine sağlıklı embriyo tutturulur. Ardından, deney için atan bir kalbe, sağlam bir yumurta sarısına ve gelişmiş kan damarlarına sahip sağlam bir embriyo arayın.
Daha sonra, tartım teknesini yavaşça iç nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve iç nemlendirilmiş odayı yumurta inkübatöründe inkübe edin. Silikon halkalar hazırlamak için, tercihen bir kağıt kesici kullanarak, sırasıyla dört milimetre ve beş milimetre iç ve dış çapa sahip bir silikon tüpü yaklaşık bir milimetre kalınlığında kesin. Ardından silikon halkaları küçük cam şişelere aktarın.
Bunları metal folyo ile örtün ve bir otoklav veya benzeri bir şey kullanarak sterilize edin. Steril silikon halkaları oda sıcaklığında saklayın. Kültür kanser hücre hatları ilgili kültür ortamında ilgi çekici hücre kültürü.
Sonra bir mililitre kolajen RPMI karışımı hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra, önce hücre kültürü ortamını çıkararak hücreleri izole etmek ve yıkayarak hücreleri izole etmek için kanser hücrelerini tripsinize edin. Daha sonra 15 santimetre çapında hücre kültürü kabı başına üç mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreler ayrılana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe iki ila üç dakika inkübe edin.
Bir masa üstü ters mikroskop kullanarak, ayrılmış hücrelere bakın. Daha sonra her hücre kültürü kabına beş mililitre tam RPMI ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve tüm hücre kültürü kaplarından hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Kanser hücrelerini saymak için, 10 mikrolitre% 0.4 tripan mavisi lekesine 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Numuneyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırdıktan sonra, oda başına 10 mikrolitre hücre karışımını hücre sayacındaki numune kaydırağına yükleyin. Daha sonra, doğru hacimli hücre kültürü süspansiyonunu beş dakika boyunca 500 kez G'de 50 mililitrelik bir tüpte santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre kollajen RPMI karışımı ile karıştırın.
Hücreler bir mililitrelik pipetle karıştırıldıktan sonra, hazırlanan hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun. Kuluçka günü 10'da, inkübatörden inkübe edilmiş kabuksuz yumurtalarla iç nemlendirilmiş odaları çıkarın. İç nemlendirilmiş odayı açtıktan sonra, sterilize forseps kullanarak CAM üzerine altı adede kadar silikon halka yerleştirin.
Kanser hücresi süspansiyonu, kanser hücrelerinin eşit dağılımını elde etmek için pipetleme ile karıştırıldıktan sonra, hazırlanan kanser hücresi süspansiyonunun 20 mikrolitresini bir silikon halka içine ekleyin. İç nemlendirilmiş odayı kapattıktan sonra, yumurta inkübatörüne koyun. 14 saat, 1,5 gün, 2,5 gün ve 3,5 günlük inkübasyondan sonra, kapaklarını birer birer açarken yaklaşık yedi iç nemlendirilmiş oda çıkarın.
Bir çift makasla TAT'a bağlı kültürlenmiş kanser hücrelerini silikon halkanın dışına keserek diseke edin. Daha sonra derhal forseps kullanarak izole edilmiş CAM-Delam numunesini, dokunun sabitlenmesi için bir Petri kabındaki 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit'e aktarın ve bir saat boyunca buz üzerinde veya dört santigrat derecede tutun. Daha sonra,% 4'lük paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve% 30'luk sakarozu CAM-Delam numunelerine 0.1 molar fosfat tamponuna ekleyin ve bir saat boyunca dört santigrat derecede dengeleyin.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, forseps kullanarak silikon halkayı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, CAM-Delam örneğini bir çift makas kullanarak ortadaki kanser hücreleri ile dikdörtgen şeklinde kesin. Daha sonra fazla sakkarozu çıkarmak için CAM-Delam numunelerini bir Petri kabında dondurulmuş kesit ortamına aktarın ve ardından kalıpları bir çift forseps ile dondurulmuş kesit ortamına gömün.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, CAM-Delam numunesini iğne benzeri herhangi bir alet kullanarak gömme kalıplarına dikey bir reaksiyonda U şeklinde yerleştirin ve CAM-Delam numunelerini 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra dondurulmuş CAM-Delam numunelerini kriyoseksiyon kullanarak beş ila altı ardışık slaytta 10 mikrometrede kesitleyin. İlk olarak, bölümlerin bittiği slaytlarda hidrofobik bir işaretleyici ile bir çizgi yapın ve birkaç dakika kurumasını bekleyin.
Daha sonra slaytları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve bölümleri yaklaşık 200 ila 500 mikrolitre bloke edici çözelti ile örtün ve 15 ila 30 dakika boyunca inkübe edin. Blokaj çözeltisini döktükten sonra, bloke edici çözeltide seyreltilmiş 100 ila 150 mikrolitre birincil antikor ile değiştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Benzer şekilde, birincil antikor çözeltisini döktükten sonra, slaytları cam küvetlere aktarın ve TBST'de her biri beş dakika boyunca en az üç kez yıkayın.
Daha sonra, fazla TBST'yi slayttan ve hidrofobik bariyer alanından yumuşak bir kağıt mendille çıkarın ve slaytı, DAPI ile kombine edilmiş blokaj çözeltisinde seyreltilmiş uygun bir ikincil floresan antikorunun 100 ila 150 mikrolitresi ile örtün. Slaytı karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İkincil antikor çözeltisini döktükten sonra, slaytları cam küvetlere aktarın ve TBST'de her biri beş dakika boyunca en az üç kez yıkayın.
Daha sonra fazla TBST'yi slayttan ve hidrofobik bariyer bölgesinden yumuşak bir kağıt mendille çıkarın. Ardından, slaytın üzerine bir ila iki damla floresan montaj ortamı koyarak slaytları monte edin ve hava kabarcıklarını önlerken yavaşça bir cam kapak kayması yerleştirin. Dijital kamera ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanarak, tercihen 10 X büyütmede bölümleri fotoğraflayın ve makalede açıklandığı gibi aşağıdaki CAM-Delam puanlama kategorilerini kullanarak bölümleri analiz edin.
İç nemlendirilmiş odaların kullanımı, civciv embriyolarının hayatta kalma oranını, kuluçka günü 10'da% 50'den% 90'a ve kuluçka günü 13'te yaklaşık% 15'ten% 80'e kadar önemli ölçüde artırmıştır. Sonuçlar, kanser hücrelerinin bazal laminayı bozma ve mezenkimi istila etme kapasitesinin, gözle görülür değişiklikler olmaksızın sağlam bazal lamina, değiştirilmiş ancak hasar görmemiş bazal lamina, hücre invazyonu olmadan hasarlı bazal lamina ve hücre invazyonu ile hasarlı bazal lamina dahil olmak üzere dört kategoriye ayrılabileceğini göstermektedir. Von Willebrand'ın faktörüne karşı antikor boyaması, kanser hücreleri değişmiş veya hasar görmüş bir bazal laminaya neden olduğunda TAT'ın kan damarı oluşumunda bir artışla kalınlaştığını göstermektedir.
Bununla birlikte, bu iki fenotipten hiçbiri, TAT sağlam olduğunda gözlenmemiştir. PC-3U hücreleri, 1.5 gün sonra hasarlı laminini indükledi ve 2.5 gün sonra net bir istila yaptı. Buna karşılık, U251 hücreleri sadece 1.5 ila 3.5 gün sonra lamininde küçük değişikliklere neden oldu, ancak lamininde hiçbir zaman gözle görülür bir hasara neden olmadı.
Kobalt klorür tedavisinden sonra, U251 metastatik olmayan kanser hücreleri, MMP inhibitörü GM6001 ile birleştirildiğinde baskılanan delaminasyon ve invaziv hücreleri indükleme yeteneğini kazanmıştır. Kanser hücrelerini tohumlarken pipet ucuyla CAM'a zarar vermemek, çünkü zarın bu şekilde hasar görmesi tahlilin okunuşlarını tahrip edecektir. Gelecekteki bir olasılık, klinik tümör örneklerinde metastatik özellikleri belirlemek için CAM-Delam yöntemini optimize etmektir, bu da gelecekte kullanılan tümör düğümü metastazı evrelemesini tamamlayabilir.
