השיטה מדמיינת ומכמתת את יכולתם של תאים סרטניים לדה-אמין ולפלוש, ובכך להיות מסוגלת להעריך את האגרסיביות הגרורתית שלהם לפני היווצרות הפעולה או גרורות. שהניקוד מבוסס על תהליך ההפחתה כתנאי מוקדם להיווצרות גרורות, ובכך משיג מידע על האגרסיביות הגרורתית של התאים בצורה מהירה יחסית, קלה וזולה. תרגלו תחילה את הצעדים האינדיבידואליים השונים לפני תחילת הניסוי עצמו.
מבחן CAM-Delam כולל מספר שלבים טכניים שקשה להסבירם בכתב והרבה יותר קל להעריך וללמוד על ידי הדגמה חזותית. כדי להתחיל להניח את מספר הביצים הרצוי במגשי ביצים ולדגום את ביצי האפרוחים אופקית באינקובטור ביצים. לאחר מכן מעקרים 30 סירות שקילה ו -30 קופסאות פלסטיק קטנות עם כובעים שקופים על ידי ריסוס 70% אתנול.
לאחר מכן, יש לייבש את סירות השקילה והקופסאות במכסה מנוע למינרי למשך הלילה ולאחסן בקופסת פלסטיק סגורה עד לשימוש נוסף ביום הדגירה השלישי. לעקר שני ליטרים של מים מזוקקים או שעברו דה-יוניזציה לכל 30 ביצים דגירה, שני זוגות מספריים ושלושה זוגות מלקחיים. ראשית, מוסיפים כ-50 מיליליטרים של מים מעוקרים לקופסאות הפלסטיק המעוקרות וסוגרים את המכסים.
ביום הדגירה השלישי, לפצח את קליפת הביצה באמצעות החלק החד של המספריים ולחתוך פתח ישר בקליפה. לאחר פתיחת קליפת הביצה באופן ידני מעל סירת שקילה, אספו את חלבון הביצה, החלמון, והוא מחובר לעובר בריא בסירת השקילה. לאחר מכן חפשו עובר שלם עם לב פועם, חלמון שלם וכלי דם מפותחים לניסוי.
לאחר מכן, מעבירים בעדינות את סירת השקילה לתא לח פנימי ומדגרים את החדר הלח הפנימי באינקובטור הביצים. כדי להכין טבעות סיליקון, חותכים צינור סיליקון בקוטר פנימי וחיצוני של ארבעה מילימטרים וחמישה מילימטרים בהתאמה בעובי של כמילימטר אחד, רצוי באמצעות חותך נייר. לאחר מכן העבירו את טבעות הסיליקון לבקבוקי זכוכית קטנים.
מכסים אותם בנייר כסף מתכת ומעקרים באמצעות אוטוקלאב או דומה. אחסנו את טבעות הסיליקון הסטריליות בטמפרטורת החדר. תרבית את קווי העניין של התאים הסרטניים במדיום התרבית הרלוונטי בתרבית התאים.
לאחר מכן להכין מיליליטר אחד של תערובת RPMI קולגן ולשמור אותו על הקרח. לאחר מכן, נסה את התאים הסרטניים לבודד את התאים על ידי הסרת מדיום תרביות התאים תחילה ושטיפתם. לאחר מכן מוסיפים שלושה מיליליטרים של תמיסת טריפסין לכל צלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ ומדגרים במשך שתיים עד שלוש דקות בחממת תרביות תאים עד שהתאים מתנתקים.
באמצעות מיקרוסקופ הפוך שולחני, ראו את התאים המנותקים. לאחר מכן השביתו את הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטרים של מדיום RPMI שלם לכל צלחת תרבית תאים ואספו את תרחיף התאים מכל מנות תרביות התאים לצינור של 50 מיליליטר. כדי לספור את התאים הסרטניים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תרחיף התא ל-10 מיקרוליטרים של כתם כחול טריפאן של 0.4%.
לאחר ערבוב הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים, טענו 10 מיקרוליטרים של תערובת התאים לכל תא לתוך שקופית הדגימה במונה התא. לאחר מכן, צנטריפוגה תרחיף תרבית תאים בנפח הנכון בצינור 50 מיליליטר ב-500 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, ערבבו את גלולת התא עם מיליליטר אחד של תערובת הקולגן RPMI.
לאחר שהתאים מעורבבים עם פיפטה של מיליליטר אחד, שמרו על תרחיף התא המוכן על הקרח. ביום הדגירה 10, מוציאים את התאים הלחים הפנימיים עם הביצים נטולות הקליפות המדגרות מהאינקובטור. לאחר פתיחת התא הלח הפנימי, הניחו עד שש טבעות סיליקון על ה-CAM באמצעות מלקחיים מעוקרים.
לאחר שהתרחיף של התא הסרטני מעורבב על ידי צנרת כדי לקבל חלוקה שווה של תאים סרטניים, הוסף 20 מיקרוליטרים של תרחיף התא הסרטני המוכן בתוך טבעת סיליקון. לאחר סגירת החדר הלח הפנימי, לשים אותו בחממת הביצים. לאחר 14 שעות, 1.5 ימים, 2.5 ימים ו-3.5 ימים של דגירה, מוציאים כשבעה תאים פנימיים לחים תוך פתיחת המכסים בזה אחר זה.
בעזרת זוג מספריים, נתחו את התאים הסרטניים בתרבית המחוברים ל-CAM על ידי חיתוך מחוץ לטבעת הסיליקון. לאחר מכן העבירו מיד את דגימת CAM-Delam המבודדת באמצעות מלקחיים ל-4% פרפורמלדהיד ב-0.1 חיץ פוספט טוחן בצלחת פטרי לקיבוע הרקמה ולשמור על קרח או בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, הסר את תמיסת 4% paraformaldehyde והוסף 30% סוכרוז ב- 0.1 חיץ פוספט טוחן לדגימות CAM-Delam ושיווי משקל בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את טבעת הסיליקון באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, חתכו את דגימת CAM-Delam בצורה מלבנית עם התאים הסרטניים באמצע באמצעות זוג מספריים. לאחר מכן העבר את דגימות ה- CAM-Delam למדיום חתך קפוא בצלחת פטרי כדי להסיר עודף סוכרוז ולאחר מכן להטמעת תבניות במדיום חתך קפוא עם זוג מלקחיים.
תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מקם את דגימת CAM-Delam בצורת U בתגובה אנכית בתבניות ההטבעה באמצעות כל מכשיר דמוי מחט ואחסן את דגימות CAM-Delam ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן חתכו את דגימות ה-CAM-Delam הקפואות ב-10 מיקרומטרים בחמש עד שש שקופיות רצופות באמצעות cryosectioning. ראשית, צרו קו עם סמן הידרופובי על השקופיות שבהן מסתיימים החלקים ותנו להם להתייבש במשך כמה דקות.
לאחר מכן מניחים את המגלשות בתא לח ומכסה את החלקים בכ-200 עד 500 מיקרוליטרים של תמיסת חסימה ודגירה למשך 15 עד 30 דקות. לאחר ששפכו את התמיסה החוסמת, החליפו אותה ב-100 עד 150 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי בעל העניין המדולל בתמיסה החוסמת והדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. באופן דומה, לאחר שמזגנו את תמיסת הנוגדנים העיקרית, העבירו את המגלשות לקובטות הזכוכית ושטפו לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת ב-TBST.
לאחר מכן, הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה וכסה את המגלשה ב-100 עד 150 מיקרוליטרים של נוגדן פלואורסצנטי משני מתאים המדולל בתמיסת חסימה בשילוב עם DAPI. דגירה של המגלשה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שמזגנו את תמיסת הנוגדנים המשנית, העבירו את המגלשות לקובטות הזכוכית ושטפו לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת ב-TBST.
לאחר מכן הסר עודף TBST מהמגלשה ומאזור המחסום ההידרופובי עם רקמת נייר רכה. לאחר מכן, הרכיבו את המגלשות על ידי הצבת טיפות אחת עד שתיים של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על המגלשה והניחו בעדינות החלקת כיסוי זכוכית תוך הימנעות מבועות אוויר. צלמו את הקטעים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית, רצוי בהגדלה של פי 10 וניתחו את הקטעים באמצעות קטגוריות הניקוד הבאות של CAM-Delam כמתואר בכתב היד.
השימוש בתאי לחות פנימיים שיפר משמעותית את שיעור ההישרדות של עוברי האפרוחים מפחות מ-50% עד 90% ביום הדגירה 10 וכ-15% עד 80% ביום הדגירה ה-13. התוצאות מראות כי ניתן להבקיע את יכולתם של תאים סרטניים לפרק את הלמינה הבסיסית ולפלוש למזנכים לארבע קטגוריות, כולל למינה בסיסית שלמה ללא שינויים נראים לעין, למינה בסיסית שונה אך לא פגומה, למינה בסיסית פגומה ללא פלישת תאים, ולמינה בסיסית פגומה עם פלישה לתאים. צביעת נוגדנים כנגד הגורם של פון וילברנד מראה כי ה-CAM היה מעובה גם עם עלייה בהיווצרות כלי הדם כאשר תאים סרטניים גרמו ללמינה בסיסית שונה או פגומה.
עם זאת, אף אחד משני הפנוטיפים הללו לא נצפה כאשר ה-CAM היה שלם. תאי PC-3U גרמו ללמינין פגום לאחר 1.5 ימים עם פלישה ברורה לאחר 2.5 ימים. לעומת זאת, תאי U251 גרמו לשינויים קלים של למינין רק לאחר 1.5 עד 3.5 ימים, אך מעולם לא גרמו לנזק נראה לעין ללאמינין.
לאחר טיפול בקובלט כלוריד, תאים סרטניים לא גרורתיים U251 רכשו את היכולת לגרום לדליה ותאים פולשניים, אשר דוכאו בשילוב עם מעכב MMP, GM6001. לא לפגוע ב- CAM עם קצה הפיפטה בעת זריעת התאים הסרטניים מכיוון שנזק כזה של הממברנה יהרוס את הקריאות של הבדיקה. אפשרות עתידית היא לייעל את שיטת CAM-Delam כדי לקבוע תכונות גרורתיות בדגימות גידול קליניות, אשר עשויות להשלים בעתיד את ההיערכות של גרורות צומת הגידול המשמשות כיום.
