O método visualiza e quantifica a capacidade das células cancerígenas de delaminar e invadir, podendo assim avaliar sua agressividade metastática antes da formação de ação ou metástase. Que a pontuação é baseada no processo de delaminação como pré-requisito para a formação de metástases, obtendo assim informações sobre a agressividade metastática das células de forma relativamente rápida, fácil e barata. Pratique os diferentes passos individuais primeiro antes de iniciar o experimento real.
O ensaio cam-Delam inclui várias etapas técnicas que são difíceis de explicar por escrito e muito mais fáceis de apreciar e aprender por demonstração visual. Para começar, coloque o número desejado de ovos em bandejas de ovos e incubar os ovos de filhote horizontalmente em uma incubadora de ovos. Em seguida, esterilize 30 barcos pesagem e 30 pequenas caixas plásticas com tampas transparentes pulverizando 70% de etanol.
Em seguida, seque os barcos de pesagem e caixas em um capô laminar durante a noite e armazene em uma caixa de plástico fechada até mais uso no terceiro dia de incubação. Esterilize dois litros de água destilada ou desionizada por 30 ovos incubados, dois pares de tesouras e três pares de fórceps. Primeiro, adicione aproximadamente 50 mililitros de água esterilizada às caixas plásticas esterilizadas e feche as tampas.
No terceiro dia de incubação, quebre a casca de ovo usando a parte afiada da tesoura e corte uma abertura reta na casca. Depois de abrir a casca de ovo manualmente sobre um barco de pesagem, colete a clara de ovo, a gema, e ela está presa embrião saudável no barco de pesagem. Então procure um embrião intacto com um coração pulsante, gema intacta, e desenvolvido vasos sanguíneos para o experimento.
Em seguida, transfira suavemente o barco de pesagem para uma câmara umidificada interna e incubar a câmara umidificada interna na incubadora de ovos. Para preparar anéis de silicone, corte um tubo de silicone com um diâmetro interno e externo de quatro milímetros e cinco milímetros, respectivamente, em aproximadamente um milímetro de espessura, de preferência usando um cortador de papel. Em seguida, transfira os anéis de silicone para pequenas garrafas de vidro.
Cubra-os com papel alumínio e esterilize usando uma autoclave ou similar. Armazene os anéis de silicone estéreis à temperatura ambiente. Cultura as linhas cancerígenas de interesse no meio cultural relevante na cultura celular.
Em seguida, prepare um mililitro de colágeno RPMI misturar e mantê-lo no gelo. Em seguida, tentepsinizar as células cancerígenas para isolar as células, removendo primeiro o meio de cultura celular e lavando. Em seguida, adicione três mililitros de solução de trippsina por prato de cultura celular de 15 centímetros de diâmetro e incubar por dois a três minutos em uma incubadora de cultura celular até que as células se desprendem.
Usando um microscópio invertido de mesa, veja as células separadas. Em seguida, inativar trippsina adicionando cinco mililitros de meio RPMI completo a cada prato de cultura celular e coletar a suspensão celular de todos os pratos de cultura celular em um tubo de 50 mililitros. Para contar as células cancerígenas, adicione 10 microliters da suspensão celular a 10 microliters de 0,4% de mancha azul trypan.
Depois de misturar a amostra por pipetação para cima e para baixo algumas vezes, carregue 10 microliters da mistura celular por câmara no slide da amostra no contador celular. Em seguida, centrifugar a suspensão correta da cultura celular de volume em um tubo de 50 mililitro a 500 vezes G por cinco minutos. Depois de descartar o supernante, misture a pelota celular com um mililitro da mistura RPMI de colágeno.
Uma vez que as células são misturadas com uma pipeta de um mililitro, mantenha a suspensão celular preparada no gelo. No dia 10 de incubação, retire as câmaras umidificadas internas com os ovos incubados sem casca da incubadora. Após abrir a câmara umidificada interna, coloque até seis anéis de silicone na CAM usando fórceps esterilizados.
Uma vez que a suspensão da célula cancerosa é misturada por pipetação para obter uma distribuição uniforme de células cancerosas, adicione 20 microliters da suspensão de células cancerígenas preparadas dentro de um anel de silicone. Depois de fechar a câmara umidificada interna, coloque-a na incubadora de ovos. Após 14 horas, 1,5 dias, 2,5 dias e 3,5 dias de incubação, tire aproximadamente sete câmaras umidificadas internas enquanto abre as tampas uma de cada vez.
Com um par de tesouras, disseca as células cancerígenas cultivadas presas à CAM cortando fora do anel de silicone. Em seguida, transfira imediatamente a amostra isolada cam-delam usando fórceps para 4% paraformaldeído em 0,1 tampão molar fosfato em uma placa de Petri para fixação do tecido e manter no gelo ou em quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova a solução de paraformaldeído de 4% e adicione 30% de sacarose em 0,1 tampão molar fosfato às amostras cam-delam e equilibre a quatro graus Celsius por uma hora.
Sob um microscópio de dissecção, remova cuidadosamente o anel de silicone usando fórceps. Em seguida, corte a amostra CAM-Delam em uma forma retangular com as células cancerosas no meio usando um par de tesouras. Em seguida, transfira as amostras cam-delam para o meio de seção congelada em uma placa de Petri para remover o excesso de sacarose e, em seguida, para incorporar moldes em meio de seção congelada com um par de fórceps.
Sob um microscópio de dissecção, posicione a amostra CAM-Delam em forma de U em uma reação vertical nos moldes de incorporação usando qualquer instrumento semelhante a agulha e armazene as amostras de CAM-Delam a 80 graus Celsius. Em seguida, se sectionia as amostras de CAM-Delam congeladas a 10 micrômetros em cinco a seis slides consecutivos usando criosectioning. Primeiro, faça uma linha com um marcador hidrofóbico nos slides onde as seções terminam e deixe-as secar por alguns minutos.
Em seguida, coloque os slides em uma câmara umidificada e cubra as seções com aproximadamente 200 a 500 microliters de solução de bloqueio e incubar por 15 a 30 minutos. Depois de derramar a solução de bloqueio, substitua-a por 100 a 150 microlitres do anticorpo primário de interesse diluído na solução de bloqueio e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Da mesma forma, depois de derramar a solução de anticorpos primários, transfira os slides para as cuvetas de vidro e lave pelo menos três vezes por cinco minutos cada em TBST.
Em seguida, remova o excesso de TBST da lâmina e da área de barreira hidrofóbica com um tecido de papel mole e cubra o slide com 100 a 150 microliters de um anticorpo fluorescente secundário adequado diluído em solução de bloqueio combinada com DAPI. Incubar o slide no escuro à temperatura ambiente por uma hora. Depois de derramar a solução de anticorpos secundários, transfira os slides para as cuvetas de vidro e lave pelo menos três vezes por cinco minutos cada em TBST.
Em seguida, remova o excesso de TBST da lâmina e da área de barreira hidrofóbica com um tecido de papel mole. Em seguida, monte os slides colocando uma a duas gotas de meio de montagem fluorescente no slide e coloque suavemente um deslizamento de tampa de vidro, evitando bolhas de ar. Fotografe as seções usando um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital, de preferência a 10 X de ampliação e analise as seções usando as seguintes categorias de pontuação CAM-Delam, conforme descrito no manuscrito.
O uso de câmaras umidificadas internas melhorou significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões filhotes de menos de 50% até 90% no dia 10 de incubação e de aproximadamente 15% até 80% no dia da incubação 13. Os resultados mostram que a capacidade das células cancerígenas de degradar a lamina basal e invadir o mesenquime pode ser pontuada em quatro categorias, incluindo lamina basal intacta sem alterações visíveis, lamina basal alterada, mas não danificada, lamina basal danificada sem invasão celular, e lamina basal danificada com invasão celular. A coloração de anticorpos contra o fator de von Willebrand mostra que o CAM também foi engrossado com um aumento na formação de vasos sanguíneos quando as células cancerígenas causaram uma lamina basal alterada ou danificada.
No entanto, nenhum desses dois fenótipos foram observados quando a CAM estava intacta. As células PC-3U induziram laminina danificada após 1,5 dias com invasão clara após 2,5 dias. Em contraste, as células U251 só induziram pequenas alterações de laminina após 1,5 a 3,5 dias, mas nunca causaram danos visíveis à laminina.
Após o tratamento do cloreto de cobalto, as células cancerígenas não metastáticas U251 adquiriram a capacidade de induzir delaminação e células invasivas, que foram suprimidas quando combinadas com o inibidor de MMP, GM6001. Para não danificar a CAM com a ponta da pipeta ao semear as células cancerosas, uma vez que tal dano da membrana destruirá as leituras do ensaio. Uma possibilidade futura é otimizar o método CAM-Delam para determinar propriedades metastáticas em amostras de tumores clínicos, o que poderia se complementar ao estágio de metástase do nódulo tumoral usado hoje.
