이 방법은 암세포가 박리되고 침입하는 능력을 시각화하고 정량화하여 작용 형성 또는 전이 전에 전이성 공격성을 평가할 수 있습니다. 점수 매기기는 전이 형성의 전제 조건으로 박리 과정을 기반으로하므로 상대적으로 빠르고 쉽고 저렴한 방식으로 세포의 전이성 공격성에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 실제 실험을 시작하기 전에 먼저 다른 개별 단계를 연습하십시오.
CAM-Delam 분석에는 서면으로 설명하기 어렵고 시각적 데모를 통해 이해하고 배우기가 훨씬 쉬운 몇 가지 기술적 단계가 포함되어 있습니다. 계란 쟁반에 원하는 수의 알을 놓고 계란 인큐베이터에서 병아리 알을 수평으로 배양하십시오. 그런 다음 70 % 에탄올을 분무하여 30 개의 계량 보트와 투명 캡이있는 30 개의 작은 플라스틱 상자를 살균하십시오.
다음으로, 계량 보트와 상자를 하룻밤 동안 층상 후드에서 건조시키고 부화일에 추가로 사용할 때까지 닫힌 플라스틱 상자에 보관하십시오. 배양 된 계란 30 개당 증류수 또는 탈 이온수 두 리터, 가위 두 쌍 및 포셉 3 쌍을 살균하십시오. 먼저 멸균 된 플라스틱 상자에 약 50 밀리리터의 멸균수를 넣고 뚜껑을 닫으십시오.
잠복기 셋째 날에는 가위의 날카로운 부분을 사용하여 달걀 껍질을 부수고 껍질에서 곧은 구멍을 자릅니다. 계량 보트를 통해 달걀 껍질을 수동으로 연 후 달걀 흰자위, 노른자를 모으고 계량 보트에 건강한 배아를 부착합니다. 그런 다음 심장이 뛰고, 노른자가 손상되지 않았으며, 실험을 위해 혈관이 발달 된 손상되지 않은 배아를 찾으십시오.
다음으로, 칭량 보트를 내부 가습 챔버로 부드럽게 옮기고 계란 인큐베이터에서 내부 가습 챔버를 인큐베이션한다. 실리콘 링을 제조하기 위해, 내외경이 각각 네 밀리미터와 다섯 밀리미터인 실리콘 튜브를 대략 한 밀리미터 두께로 절단하고, 바람직하게는 종이 절단기를 사용한다. 그런 다음 실리콘 링을 작은 유리 병으로 옮깁니다.
금속 호일로 덮고 오토클레이브 또는 이와 유사한 것을 사용하여 살균하십시오. 멸균 실리콘 링을 실온에서 보관하십시오. 관련 배양 배지에 관심있는 암 세포주를 세포 배양에서 배양한다.
그런 다음 콜라겐 RPMI 믹스 한 밀리리터를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 암세포를 트립신화하여 먼저 세포 배양 배지를 제거하고 세척함으로써 세포를 분리한다. 그런 다음 직경 15 센티미터 당 3 밀리리터의 트립신 용액을 세포 배양 접시에 첨가하고 세포가 분리 될 때까지 세포 배양 배양기에서 두 세 분 동안 배양한다.
탁상용 거꾸로 현미경을 사용하여 분리 된 세포를 참조하십시오. 그런 다음 각 세포 배양 접시에 5 밀리리터의 완전한 RPMI 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화시키고 모든 세포 배양 접시에서 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 수집합니다. 암세포를 계수하려면 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 0.4 % 트리판 블루 염색 10 마이크로 리터에 첨가하십시오.
샘플을 몇 번 위아래로 피펫팅하여 혼합한 후, 챔버 당 10 마이크로리터의 세포 혼합물을 세포 카운터의 샘플 슬라이드에 로딩한다. 다음에, 정확한 부피의 세포 배양 현탁액을 500배 G에서 50 밀리리터 튜브에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 콜라겐 RPMI 믹스의 한 밀리리터와 혼합한다.
세포가 한 밀리리터 피펫과 혼합되면 준비된 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. 인큐베이션 10 일째에, 인큐베이터에서 인큐베이터 껍질이없는 알과 함께 내부 가습 챔버를 꺼내십시오. 내부 가습 챔버를 연 후 멸균 된 포셉을 사용하여 CAM에 최대 여섯 개의 실리콘 링을 놓습니다.
일단 암세포 현탁액이 피펫팅에 의해 혼합되어 암세포의 균일한 분포를 얻으면, 제조된 암세포 현탁액 20 마이크로리터를 실리콘 링 내부에 첨가한다. 내부 가습실을 닫은 후 계란 인큐베이터에 넣으십시오. 14 시간, 1.5 일, 2.5 일 및 3.5 일의 배양 후 한 번에 하나씩 뚜껑을 열면서 약 7 개의 내부 가습실을 꺼내십시오.
한 쌍의 가위로 CAM에 부착된 배양된 암세포를 실리콘 고리 외부로 절단하여 해부한다. 그런 다음 포셉을 사용하여 단리된 CAM-Delam 샘플을 즉시 조직의 고정을 위해 페트리 접시의 0.1 몰 인산염 완충액 중 4% 파라포름알데히드로 옮기고 얼음 위에 또는 섭씨 4도에서 1시간 동안 유지한다. 다음으로, 4% 파라포름알데히드 용액을 제거하고 0.1 몰 인산염 완충액 중 30%수크로오스를 CAM-Delam 샘플에 첨가하고, 섭씨 4도에서 1시간 동안 평형화시킨다.
해부 현미경으로 포셉을 사용하여 실리콘 링을 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로, 한 쌍의 가위를 이용하여 중간에 암세포와 함께 CAM-Delam 샘플을 직사각형 모양으로 절단한다. 그런 다음 CAM-Delam 샘플을 페트리 접시의 냉동 섹션 배지로 옮겨 과도한 자당을 제거한 다음 한 쌍의 포셉으로 냉동 섹션 배지에 몰드를 매립합니다.
해부 현미경 하에서, CAM-Delam 샘플을 바늘 형상 기기를 사용하여 임베딩 몰드에서 수직 반응으로 U 자형으로 배치하고 CAM-Delam 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 그런 다음 냉동 CAM-Delam 샘플을 냉동 절법을 사용하여 다섯 개 내지 여섯 개의 연속 슬라이드에서 10 마이크로미터로 절편화합니다. 먼저, 섹션이 끝나는 슬라이드에 소수성 마커가있는 선을 만들고 몇 분 동안 말리십시오.
그런 다음 슬라이드를 가습 챔버에 놓고 약 200 내지 500 마이크로리터의 블로킹 용액으로 절편을 덮고 15 내지 30분 동안 인큐베이션한다. 블로킹 용액을 붓고 난 후, 블로킹 용액에 희석된 관심있는 일차 항체의 100 내지 150 마이크로리터로 교체하고 섭씨 네 도에서 밤새 인큐베이션한다. 마찬가지로, 일차 항체 용액을 붓고 난 후, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고 TBST에서 각각 다섯 분 동안 적어도 세 번 세척한다.
다음으로, 슬라이드로부터 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역으로부터 슬라이드를 표지하고, DAPI와 결합된 블로킹 용액에 희석된 적합한 이차 형광 항체의 100 내지 150 마이크로리터로 슬라이드를 덮는다. 슬라이드를 실온에서 한 시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다. 이차 항체 용액을 붓고 난 후, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고 TBST에서 각각 다섯 분 동안 적어도 세 번 세척한다.
그런 다음 슬라이드에서 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역으로부터 제거한다. 그런 다음 슬라이드에 형광 장착 매체를 한 두 방울 떨어 뜨려 슬라이드를 장착하고 기포를 피하면서 유리 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 디지털 카메라가 장착된 후피형광 현미경을 이용하여 단면을 촬영하고, 바람직하게는 10 X 배율로 촬영하고, 원고에 기재된 바와 같이 다음의 CAM-Delam 스코어링 카테고리를 사용하여 섹션을 분석한다.
내부 가습 챔버의 사용은 병아리 배아의 생존율을 배양 10 일째에 50 % 미만에서 90 %까지, 그리고 배양 13 일째에 약 15 %에서 80 %까지 크게 향상시켰다. 결과는 기저 라미나를 분해하고 중간엽을 침범하는 암세포의 능력이 눈에 보이는 변화없이 손상되지 않은 기저 라미나, 변경되었지만 손상되지 않은 기저 라미나, 세포 침윤이없는 손상된 기저 라미나 및 세포 침범으로 손상된 기저 라미나를 포함하여 네 가지 범주로 점수화 될 수 있음을 보여줍니다. 폰 빌레브란트의 인자에 대한 항체 염색은 암세포가 변경되거나 손상된 기저 라미나를 야기했을 때 혈관 형성의 증가로 CAM이 두꺼워졌다는 것을 보여준다.
그러나 CAM이 손상되지 않았을 때이 두 표현형 중 어느 것도 관찰되지 않았습니다. PC-3U 세포는 2.5일 후에 명확한 침윤과 함께 1.5일 후에 손상된 라미닌을 유도하였다. 대조적으로, U251 세포는 1.5 내지 3.5일 후에 라미닌의 경미한 변화만을 유도했을 뿐, 라미닌에 어떠한 가시적인 손상도 일으키지 않았다.
염화코발트 처리 후, U251 비-전이성 암 세포는 박리 및 침습성 세포를 유도하는 능력을 획득하였고, 이는 MMP 억제제인 GM6001과 조합될 때 억제되었다. 암 세포를 시딩할 때 피펫 팁으로 CAM을 손상시키지 않는 것은 이러한 막의 손상이 분석의 판독을 파괴할 것이기 때문이다. 미래의 가능성은 임상 종양 샘플에서 전이성 특성을 결정하기 위해 CAM-Delam 방법을 최적화하는 것이며, 이는 오늘날 사용되는 종양 노드 전이 병기를 보완 할 수 있습니다.
