يحفز هذا النموذج المحفزات الميكانيكية الحيوية التي تعاني منها خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي البشري. جنبا إلى جنب مع الخلايا المشتقة من المرضى ، يمكن استخدام هذا النظام لفحص المخدرات والطب الشخصي لأمراض الأبهر. يمكن لهذا النموذج أن يحاكي ويتحكم بدقة في المعلمات الميكانيكية المجردة لخلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي البشري ، مما يوفر منصة جديدة في المختبر لدراسة أمراض الأبهر والتسبب فيها.
سيوضح الإجراء Mieradilijiang Abudubat ، طبيب الملصقات من مختبرنا. ابدأ بغسل المنطقة الجانبية اليمنى من الشريان الأورطي الصاعد باستخدام pbs معقمة ، مرة أو مرتين. قم بإزالة طبقات intima و adventitia من الأنسجة باستخدام ملقطين عينيين واحتفظ بطبقة الوسائط لحصاد الخلايا.
ضع طبقة الوسائط على طبق طوله 10 سم وقطعها إلى قطعتين إلى ثلاث ملليمترات. ثم أضف خمسة ملليلتر من SMCM تحتوي على 10٪ fbs و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى عينات الأنسجة. انقل الأنسجة الصغيرة إلى زجاجة الثقافة باستخدام قطارة معقمة ، وانشر الأنسجة بالتساوي.
تجاهل وسط الثقافة قدر الإمكان. ثم اقلب الزجاجة رأسا على عقب. أضف ملليلتر من SMCM إلى زجاجة الثقافة المقلوبة وضعها في الحاضنة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.
ثم اقلبه ببطء إلى الجانب الأيمن لأعلى وأضف ملليلتر آخر من SMCM. بعد خمسة إلى سبعة أيام من الحضانة ، استبدل SMCM بأربعة ملليلتر من SMCM الطازج. تخلص ببطء وأضف SMCM عند تغيير الوسيط.
بشكل عام، تتسلق خلايا العضلات الملساء المتفرقة في غضون أسبوعين تقريبا. انقل زجاجة الثقافة برفق عند الانتقال إلى محطة المجهر. خلاف ذلك ، سوف تطفو الأنسجة وسوف تنمو الخلايا ببطء.
عندما تنمو الخلايا ، قسمها إلى زجاجتين جديدتين مع أربعة ملليلتر من SMCM الطازجة. تحديد الخلايا من خلال تحليل التألق المناعي لأربع علامات محددة لخلايا العضلات الملساء. لبلمرة PDMS ، أضف عامل المعالجة أو المكون B إلى القاعدة أو المكون A واخلط المركب لمدة خمس دقائق.
يعتمد الحجم على حاجة الدراسة. ضع جل PDMS المحضر في خزان شفط فراغ لمدة 30 إلى 60 دقيقة وحافظ على الضغط أقل من سالب 0.8 مللي باسكال. باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر ، صمم القالب.
العرف جعل قوالب الطبقات الثلاث باستخدام آلة النقش التحكم العددي الكمبيوتر عالية الدقة. بعد نحت إطار القوالب والقنوات الدقيقة باستخدام ألواح PMMA ، قم بلصقها على لوحة أخرى. صب هلام PDMS المحضر على قالب مصمم.
ثم قم بالربط المتقاطع عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. انزع ألواح PDMS المتشابكة من القالب وقطع أغشية PDMS التجارية إلى أقسام 100 ملم × 40 ملم. قم بعمل ثقوب على ألواح PDMs الثلاثة باستخدام ثقب ثقب ملليمتر واحد لعمل مدخل ومخرج الهواء والقنوات الدقيقة المتوسطة على شريحة PDMS.
عالج ألواح PDMS الثلاثة المحضرة وأغشية PDMS ببلازما الأكسجين لمدة خمس دقائق لتنشيط سطح PDMs. اضبط هواء الغرفة على معالجة الغاز ، والضغط على سالب 100 كيلو باسكال ، والتيار إلى 180 إلى 200 مللي أمبير ، والجهد إلى 200 فولت ، ووقت المعالجة إلى خمس دقائق. اربط ثلاثة ألواح PDMS واثنين من أغشية PDMS معا تحت مجهر مجسم ، بحيث تتكون الطبقة العليا من لوح PDMS للقناة الهوائية ، ثم غشاء PDMS.
تتكون القناة المتوسطة من لوح PDMS ، ثم غشاء PDMs ، والطبقة السفلية هي لوح PDMS للقناة الهوائية. ضع شريحة PDMS المجمعة في حاضنة 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إعداد عدة قطر داخلي واحد ملليمتر وثلاثة خراطيم اللاتكس طول سنتيمتر.
أدخل قطرا خارجيا بحجم ملليمتر واحد وإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ بطول سنتيمتر واحد في أحد طرفي الخرطوم المعد. ثم أدخل إغراء في الطرف الآخر من الخرطوم لإنشاء الأنبوب المتصل بالهواء والقنوات الدقيقة المتوسطة لشريحة PDMS. أدخل الأنابيب المعدة في منافذ ومداخل الهواء والقنوات الدقيقة المتوسطة على شريحة PDMS.
قم بضخ ملليلتر من 80 ملليغرام لكل ملليلتر من كولاجين الفأر في القناة الدقيقة المتوسطة لشريحة PDMs ، باستخدام حقنة 2 ملليلتر ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الكولاجين من القناة باستخدام حقنة سعة 2 ملليلتر. ضع رقائق PDMS المشفرة بالكولاجين في حاضنة 60 درجة مئوية طوال الليل.
ضع رقائق PDMS في معقم للأشعة فوق البنفسجية لأكثر من ساعة. ضع رقائق PDMS المعقمة على مقعد نظيف للغاية استعدادا لتجربة الخلية. استزرع أربعة أضعاف 10 إلى خمس خلايا عضلية ملساء شريطية بشرية أساسية من المرضى الذين يستخدمون SMCM تحتوي على 2٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، تم ضبطها على 37 درجة مئوية.
عندما تصل كثافة خلايا العضلات الملساء إلى 80٪ ، تخلص من SMCM ، واغسل الخلايا بملليلتر من PPS. هضم الخلايا باستخدام ملليلتر واحد من 0.25٪ tripsin لمدة دقيقتين وأجهزة الطرد المركزي في 100 RCF لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من SMCM الطازج.
استخدم ثمانية ملليلتر من SMCM لزراعة الخلايا على طبق زراعة 10 سم. باستخدام مقياس الخلوي ، احسب رقم الخلية وتابع التركيز النهائي لاثنين في 10 أس خمس خلايا لكل ملليلتر. صب ببطء مليلتر من PBS في القناة الدقيقة المتوسطة لرقاقة PDMS المشفرة والمعقمة بالكولاجين ثم تخلص منها لاحقا باستخدام حقنة سعة 2 ملليلتر.
صب ببطء مليلتر من اثنين في 10 إلى خمس خلايا لكل ملليلتر تعليق خلايا العضلات الملساء في القناة الدقيقة للوسائط لشريحة PDMS. ثم أغلق الإغراء عند مدخل ومخرج شريحة PDMS. ضع شريحة PDMS في حاضنة ، اضبطها على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ليوم واحد.
بعد الحضانة ، عندما يتم توصيل الخلايا بغشاء PDMS في شريحة PDMS ، قم بتوصيل مخرج القناة الدقيقة الهوائية على شريحة PDMS بنظام التحكم في الفراغ. سيظهر شكل خلوي طبيعي ممدود تحت المجهر عند توصيل الخلية. على النقيض من الخلايا المستديرة المعلقة.
قم بتشغيل صمام الملف اللولبي ومضخة التفريغ. افتح منظم الفراغ واضبط مستوى الضغط حسب السلالات. بعد ذلك ، ضع رقائق PDMS وحاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
قم بإعداد العديد من صمامات الملف اللولبي ، ومرشحات الفراغ ، ومنظمات التفريغ ، ومضخة التفريغ ، والمضخة التمعجية ، و PLC التي تتحكم في صمام الملف اللولبي. قم ببرمجة وحدة تحكم PLC واضبط الفاصل الزمني لإيقاف التشغيل على هرتز واحد. قم بتوصيل صمامات الملف اللولبي بوحدة التحكم المبرمجة.
قم بتوصيل مدخل مضخة التفريغ بمرشحات التفريغ ، ثم قم بتوصيل مخرج مرشحات الفراغ بمنظمات التفريغ. قم بتوصيل مخرج منظمات الفراغ بصمامات الملف اللولبي. وأخيرا ، قم بتوصيل مخرج صمامات الملف اللولبي بمنافذ القنوات الهوائية الدقيقة لرقائق PDMS.
قم بتوصيل مخرج المضخة التمعجية بمدخل القناة الدقيقة المتوسطة لشريحة PDMS ومدخل المضخة التمعجية بمخرج شريحة PDMS ذات القناة الدقيقة المتوسطة لاستبدال وسط الاستزراع والتعامل مع الأدوية. اضبط سعة الإجهاد بواسطة المنظم وتردد الإجهاد بواسطة وحدة التحكم الدقيقة. تم تقدير صلاحية خط خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية ، CRL 1990 ، في شريحة PDMS ، باستخدام مقايسة حية وميتة في اليوم الثالث والخامس من زراعة الخلايا.
تم العثور على صلاحية الخلية أعلى من 90٪ في اليوم الثالث واليوم الخامس. أظهر تلطيخ الهيكل الخلوي F-actin ل CRL 1990 ، في شريحة PDMS ، مورفولوجيا طبيعية للخلايا وخلايا محاذاة بشكل عمودي على السلالة بعد التمدد لمدة 24 ساعة. كان التألق المناعي للعلامات المقلصة SM22 و CNN1 أعلى في ظل ظروف الإجهاد مقارنة بالظروف الساكنة.
أيضا ، تم تنظيم جينات SM22 و CNN1 في ظروف إجهاد خلايا العضلات الملساء. أظهر تلطيخ F-actin ل BAV و TAV ، تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري وتشريح خلايا العضلات الملساء الأبهرية البشرية الأولية المشتقة من المريض ، مورفولوجيا طبيعية للخلايا وخلايا محاذاة بشكل عمودي على اتجاه الإجهاد بعد التمدد لمدة 24 ساعة. كان مضان SM22 و CNN1 في تمدد الأوعية الدموية الأبهري الصدري BAVTAAD و TAV وتسلخ أعلى في ظل ظروف الإجهاد منه في ظل ظروف ثابتة.
على غرار مستويات التعبير الجيني SM22 و CNN1 ، والتي تم تنظيمها أيضا في ظروف الإجهاد مقارنة بالظروف الثابتة. يجب الانتباه إلى مبدأ العقم عند عزل HASMC الأساسي. بعد معالجة مختبرات PDMS والأغشية بالبلازما ، يجب عدم اتساخ الأسطح.
بناء على هذا البروتوكول ، يمكن زراعة الخلايا البطانية مع خلايا العضلات الملساء ويمكن إعطاء الضغط الهائل للخلايا ذات الإجهاد الدوري لمحاكاة المزيد من القوى الميكانيكية.
