Ce modèle stimule les stimuli biomécaniques ressentis par les cellules musculaires lisses de l’aorte humaine. Combiné avec des cellules dérivées de patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments et la médecine personnalisée des maladies de l’aorte. Ce modèle peut imiter et contrôler avec précision les paramètres mécaniques nus, des cellules musculaires lisses de l’aorte humaine, ce qui fournit une nouvelle plate-forme in vitro pour l’étude et la pathogenèse des maladies aortiques.
La démonstration de la procédure sera Mieradilijiang Abudubat, un médecin posteriste de notre laboratoire. Commencez par laver la région latérale droite de l’aorte ascendante avec des PBS stériles, une ou deux fois. Retirez les couches intima et adventice du tissu à l’aide de deux pinces ophtalmiques et conservez la couche de média pour prélever les cellules.
Placez la couche de média sur une boîte de 10 centimètres et coupez-la en morceaux de deux à trois millimètres. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de SMCM contenant 10% fbs et 1% de pénicilline streptomycine aux échantillons de tissus. Déplacez le petit tissu dans le flacon de culture avec un compte-gouttes stérile, en répartissant le tissu uniformément.
Jetez le milieu de culture autant que possible. Ensuite, retournez la bouteille à l’envers. Ajoutez deux millilitres de SMCM dans la bouteille de culture inversée et placez-la dans l’incubateur avec 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.
Ensuite, tournez-le lentement vers le haut et ajoutez deux autres millilitres de SMCM. Après cinq à sept jours d’incubation, échangez le SMCM avec quatre millilitres de SMCM frais. Jetez lentement et ajoutez le SMCM lors du changement du support.
Généralement, les cellules musculaires lisses sporadiques disparaissent en environ deux semaines. Transportez doucement la bouteille de culture lorsque vous vous déplacez vers une station de microscope. Sinon, les tissus flotteront et les cellules se développeront lentement.
Lorsque les cellules ont grandi, divisez-les en deux nouvelles bouteilles de culture avec quatre millilitres de SMCM frais. Identifier les cellules grâce à une analyse d’immunofluorescence de quatre marqueurs spécifiques pour les cellules musculaires lisses. Pour polymériser le PDMS, ajoutez l’agent de durcissement ou le composant B à la base ou au composant A et mélangez le complexe pendant cinq minutes.
Le volume dépendra de la nécessité de l’étude. Placez le gel PDMS préparé dans un réservoir d’extraction sous vide pendant 30 à 60 minutes et maintenez la pression en dessous de 0,8 milli pascals négatifs. À l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur, concevez le moule.
Fabriquez sur mesure les moules des trois couches à l’aide d’une machine de gravure à commande numérique par ordinateur de haute précision. Après avoir découpé le cadre des moules et des microcanaux à l’aide de plaques de PMMA, collez-les sur une autre plaque. Versez le gel PDMS préparé sur un moule conçu.
Ensuite, réticulez à 70 degrés Celsius pendant une à deux heures. Décollez les dalles PDMS réticulées du moule et coupez les membranes PDMS commercialisées en sections de 100 millimètres sur 40 millimètres. Perforez des trous sur les trois dalles PDM à l’aide d’un perforateur d’un millimètre pour faire l’entrée et la sortie d’air et de microcanaux moyens sur la puce PDMS.
Traiter les trois dalles PDMS préparées et les deux membranes PDMS avec du plasma d’oxygène pendant cinq minutes pour l’activation de la surface PDM. Réglez l’air ambiant pour traiter le gaz, la pression sur les couches négatives de 100 kilopascals, le courant sur les piliers de 180 à 200 milliampères, la tension sur 200 volts et le temps de traitement sur cinq minutes. Lier trois dalles PDMS et deux membranes PDMS ensemble sous un microscope stéréoscopique, de sorte que la couche supérieure soit constituée de la dalle PDMS du canal d’air, puis de la membrane PDMS.
Le canal moyen est constitué de la dalle PDMS, puis de la membrane PDM, et la couche inférieure est la dalle PDMS du canal d’air. Placez la puce PDMS assemblée dans un incubateur à 70 degrés Celsius pendant une heure. Préparez plusieurs tuyaux en latex d’un millimètre de diamètre intérieur et de trois centimètres de longueur.
Insérez une aiguille en acier inoxydable d’un millimètre de diamètre extérieur et d’un centimètre de long dans une extrémité du tuyau préparé. Insérez ensuite un leurre dans l’autre extrémité du tuyau pour créer le tube connecté aux microcanaux d’air et de milieu de la puce PDMS. Insérez les tubes préparés dans les sorties et les entrées de l’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.
Infuser deux millilitres de 80 milligrammes par millilitre de collagène de souris dans le microcanal moyen de la puce PDM, à l’aide d’une seringue de deux millilitres, et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le collagène du canal avec une seringue de deux millilitres. Placez les puces PDMS codées au collagène dans un incubateur à 60 degrés Celsius pendant la nuit.
Placez les puces PDMS dans un stérilisateur UV pendant plus d’une heure. Placez les puces PDMS stérilisées sur un banc ultra propre en préparation de l’expérience cellulaire. Culture quatre fois 10 aux cinq cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires de patients utilisant SMCM contenant 2% FBS et 1% de pénicilline streptomycine dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%, réglé à 37 degrés Celsius.
Lorsque la densité des cellules musculaires lisses atteint 80%, jetez le SMCM et lavez les cellules avec deux millilitres de PPS. Digérer les cellules en utilisant un millilitre de 0,25% de tripsine pendant deux minutes et centrifuger à 100 RCF pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de SMCM frais.
Utilisez huit millilitres de SMCM pour cultiver les cellules sur une boîte de culture de 10 centimètres. À l’aide d’un cytomètre, calculez le nombre de cellules et procédez à la concentration finale de deux fois 10 à cinq cellules par millilitre. Versez lentement deux millilitres de PBS dans le microcanal moyen de puce PDMS codé et stérilisé au collagène, puis jetez-le à l’aide d’une seringue de deux millilitres.
Versez lentement deux millilitres de deux fois 10 à la suspension de cellules musculaires lisses de cinq cellules par millilitres dans le microcanal multimédia de la puce PDMS. Ensuite, fermez le leurre à l’entrée et à la sortie de la puce PDMS. Placez la puce PDMS dans un incubateur, réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une journée.
Après l’incubation, lorsque les cellules sont fixées à la membrane PDMS dans la puce PDMS, connectez la sortie du microcanal d’air sur la puce PDMS au système de contrôleur de vide. Une forme cellulaire normale allongée sera observée au microscope lorsque la cellule est attachée. Contraste avec les cellules rondes suspendues.
Allumez l’électrovanne et la pompe à vide. Ouvrez le régulateur de vide et ajustez le niveau de pression en fonction des contraintes. Ensuite, placez les puces PDMS et un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Préparez plusieurs électrovannes, filtres à vide, régulateurs de vide, une pompe à vide, une pompe péristaltique et un API contrôlant l’électrovanne. Programmez le contrôleur PLC et réglez l’intervalle de temps d’arrêt à un hertz. Connectez les électrovannes au contrôleur programmé.
Connectez l’entrée de la pompe à vide aux filtres à vide, puis connectez la sortie des filtres à vide aux régulateurs de vide. Connectez la sortie des régulateurs de vide aux électrovannes. Et enfin, connectez la sortie des électrovannes aux sorties des microcanaux d’air des puces PDMS.
Connectez la sortie de la pompe péristaltique à l’entrée du microcanal moyen de la puce PDMS et l’entrée de la pompe péristaltique à la sortie de la puce PDMS à microcanal moyen pour le remplacement du milieu de culture et la manipulation des médicaments. Ajustez l’amplitude de la déformation par le régulateur et la fréquence de déformation par le microcontrôleur. La viabilité de la lignée cellulaire de muscle lisse aortique humain, CRL 1990, dans la puce PDMS, a été estimée à l’aide d’un test vivant et mort les troisième et cinquième jours de culture cellulaire.
La viabilité cellulaire a été jugée supérieure à 90% le troisième jour et le cinquième jour. La coloration du cytosquelette F-actine de CRL 1990, dans la puce PDMS, a montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la souche après un étirement de 24 heures. L’immunofluorescence des marqueurs contractiles SM22 et CNN1 était plus élevée dans des conditions de déformation par rapport aux conditions statiques.
En outre, les gènes SM22 et CNN1 ont été régulés à la hausse dans des conditions de tension des cellules musculaires lisses. La coloration par F-actine du BAV et du TAV, l’anévrisme de l’aorte thoracique et la dissection des cellules musculaires lisses aortiques humaines primaires dérivées du patient, ont montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la direction de la souche après un étirement de 24 heures. La fluorescence SM22 et CNN1 dans l’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique BAVTAAD et TAV était plus élevée dans des conditions de souche que dans des conditions statiques.
Semblable aux niveaux d’expression génique de SM22 et CNN1, qui ont également été régulés à la hausse dans des conditions de souche par rapport à des conditions statiques. Une attention particulière doit être accordée au principe de stérilité lors de l’isolement du HASMC primaire. Une fois que les laboratoires PDMS et les membranes ont été traités avec du plasma, les surfaces ne doivent pas être souillées.
Sur la base de ce protocole, les cellules endothéliales peuvent être co-cultivées avec des cellules musculaires lisses et le stress pur peut être donné aux cellules avec une contrainte cyclique pour simuler davantage plus de forces mécaniques.
