Este modelo estimula los estímulos biomecánicos experimentados por las células del músculo liso en la aorta humana. Combinado con células derivadas de pacientes, este sistema se puede utilizar para la detección de fármacos y la medicina personalizada de enfermedades aórticas. Este modelo puede imitar y controlar con precisión los parámetros mecánicos desnudos de las células del músculo liso en la aorta humana, lo que proporciona una nueva plataforma in vitro para el estudio y la patogénesis de las enfermedades aórticas.
Demostrando el procedimiento estará Mieradilijiang Abudubat, un médico de nuestro laboratorio. Comience lavando la región lateral derecha de la aorta ascendente con PBS estéril, una o dos veces. Retire las capas íntima y adventicia del tejido con dos pinzas oftálmicas y retenga la capa de medios para cosechar las células.
Coloque la capa de medios en un plato de 10 centímetros y córtelo en trozos de dos a tres milímetros. Luego, agregue cinco mililitros de SMCM que contengan 10% fbs y 1% de estreptomicina de penicilina a las muestras de tejido. Mueva el tejido pequeño al frasco de cultivo con un gotero estéril, extendiendo el tejido uniformemente.
Deseche el medio de cultivo tanto como sea posible. Luego invierta la botella boca abajo. Agregue dos mililitros de SMCM en la botella de cultivo invertida y colóquela en la incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una o dos horas.
Luego, gírelo lentamente hacia arriba y agregue otros dos mililitros de SMCM. Después de cinco a siete días de incubación, cambie el SMCM con cuatro mililitros de SMCM fresco. Deseche lentamente y agregue el SMCM al cambiar el medio.
Generalmente, las células esporádicas del músculo liso salen en aproximadamente dos semanas. Transporte la botella de cultivo suavemente cuando se mueva a una estación de microscopio. De lo contrario, los tejidos flotarán y las células crecerán lentamente.
Cuando las células hayan crecido, divídalas en dos nuevas botellas de cultivo con cuatro mililitros de SMCM fresco. Identificar las células a través de un análisis de inmunofluorescencia de cuatro marcadores específicos para las células del músculo liso. Para polimerizar PDMS, agregue el agente de curado o componente B a la base o al componente A y mezcle el complejo durante cinco minutos.
El volumen dependerá de la necesidad del estudio. Coloque el gel PDMS preparado en un tanque de extracción al vacío durante 30 a 60 minutos y mantenga la presión por debajo de 0,8 mili pascales negativos. Usando software de diseño asistido por computadora, diseñe el molde.
Personalice los moldes de las tres capas utilizando una máquina de grabado de control numérico computarizado de alta precisión. Después de tallar el marco de los moldes y los microcanales con placas de PMMA, péguelos en otra placa. Vierta el gel PDMS preparado en un molde diseñado.
Luego entrecruza a 70 grados centígrados durante una o dos horas. Despegue las losas de PDMS reticuladas del molde y corte las membranas PDMS comercializadas en secciones de 100 milímetros por 40 milímetros. Perfore agujeros en las tres losas PDM utilizando un perforador de orificios de un milímetro para hacer la entrada y salida de aire y microcanales medios en el chip PDMS.
Tratar las tres losas de PDMS preparadas y dos membranas de PDMS con plasma de oxígeno durante cinco minutos para la activación de la superficie de PDM. Ajuste el aire de la habitación para procesar gas, la presión a 100 kilopascales negativos, la corriente a muelles de 180 a 200 miliamperios, el voltaje a 200 voltios y el tiempo de procesamiento a cinco minutos. Unir tres losas PDMS y dos membranas PDMS bajo un microscopio estereoscópico, de modo que la capa superior consista en la losa PDMS del canal de aire, luego la membrana PDMS.
El canal medio consiste en la losa PDMS, luego la membrana PDM, y la capa inferior es la losa PDMS del canal de aire. Coloque el chip PDMS ensamblado en una incubadora de 70 grados centígrados durante una hora. Prepare varias mangueras de látex de un milímetro de diámetro interior y tres centímetros de longitud.
Inserte una aguja de acero inoxidable de un milímetro de diámetro exterior y un centímetro de largo en un extremo de la manguera preparada. Luego inserte un señuelo en el otro extremo de la manguera para crear el tubo conectado a los microcanales de aire y medio del chip PDMS. Inserte los tubos preparados en las salidas y entradas de los microcanales de aire y medio en el chip PDMS.
Infundir dos mililitros de 80 miligramos por mililitro de colágeno de ratón en el microcanal medio del chip PDM, usando una jeringa de dos mililitros, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el colágeno del canal con una jeringa de dos mililitros. Coloque los chips PDMS codificados en colágeno en una incubadora de 60 grados centígrados durante la noche.
Coloque los chips PDMS en un esterilizador UV durante más de una hora. Coloque los chips PDMS esterilizados en un banco ultra limpio en preparación para el experimento celular. Cultivo cuatro veces 10 a las cinco células primarias del músculo liso aórtico humano de pacientes que usan SMCM que contiene 2% FBS y 1% de estreptomicina de penicilina en una incubadora de dióxido de carbono al 5%, fijada a 37 grados centígrados.
Cuando la densidad de células del músculo liso alcance el 80%, deseche el SMCM y lave las células con dos mililitros de PPS. Digerir las células usando un mililitro de 0,25% de tripsina durante dos minutos y centrifugar a 100 RCF durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de SMCM fresco.
Use ocho mililitros de SMCM para cultivar las células en una placa de cultivo de 10 centímetros. Usando un citómetro, calcule el número de células y proceda con la concentración final de dos veces 10 a cinco células por mililitro. Vierta lentamente dos mililitros de PBS en el microcanal medio del chip PDMS codificado y esterilizado y luego deseche con una jeringa de dos mililitros.
Vierta lentamente dos mililitros de dos veces 10 a las cinco células por mililitros de suspensión de células musculares lisas en el microcanal de medios del chip PDMS. Luego, cierre el señuelo en la entrada y salida del chip PDMS. Coloque el chip PDMS en una incubadora, fijada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante un día.
Después de la incubación, cuando las células están unidas a la membrana PDMS en el chip PDMS, conecte la salida del microcanal de aire en el chip PDMS al sistema controlador de vacío. Una forma celular normal alargada se verá bajo el microscopio cuando la célula esté unida. Contrastando con las celdas redondas suspendidas.
Encienda la válvula solenoide y la bomba de vacío. Abra el regulador de vacío y ajuste el nivel de presión en función de las deformación. Luego, coloque los chips PDMS y una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Prepare varias válvulas solenoides, filtros de vacío, reguladores de vacío, una bomba de vacío, una bomba peristáltica y un PLC que controle la válvula solenoide. Programe el controlador PLC y establezca el intervalo de tiempo de encendido en un hercio. Conecte las válvulas solenoides al controlador programado.
Conecte la entrada de la bomba de vacío a los filtros de vacío y, a continuación, conecte la salida de los filtros de vacío a los reguladores de vacío. Conecte la salida de los reguladores de vacío a las válvulas solenoides. Y finalmente, conecte la salida de las válvulas solenoides a las salidas de los microcanales de aire de los chips PDMS.
Conecte la salida de la bomba peristáltica a la entrada del microcanal medio del chip PDMS y la entrada de la bomba peristáltica a la salida del chip PDMS de microcanal medio para el reemplazo del medio de cultivo y el manejo de fármacos. Ajuste la amplitud de la deformación por el regulador y la frecuencia de deformación por el microcontrolador. La viabilidad de la línea celular del músculo liso aórtico humano, CRL 1990, en el chip PDMS, se estimó utilizando un ensayo vivo y muerto en el tercer y quinto día de cultivo celular.
La viabilidad celular se encontró superior al 90% en el día tres y el día cinco. La tinción de actina F del citoesqueleto de CRL 1990, en el chip PDMS, mostró morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la cepa después de estirar durante 24 horas. La inmunofluorescencia de los marcadores contráctiles SM22 y CNN1, fue mayor en condiciones de tensión en comparación con las condiciones estáticas.
Además, los genes SM22 y CNN1 fueron regulados al alza en condiciones de tensión de las células musculares lisas. La tinción de actina F de BAV y TAV, el aneurisma de la aorta torácica y la disección de células primarias del músculo liso aórtico humano derivado del paciente, mostraron una morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la dirección de la tensión después de estirar durante 24 horas. La fluorescencia SM22 y CNN1 en el aneurisma aórtico torácico BAVTAAD y TAV y la disección fueron mayores en condiciones de tensión que en condiciones estáticas.
Similar a los niveles de expresión génica de SM22 y CNN1, que también se regularon al alza en condiciones de tensión en comparación con las condiciones estáticas. Se debe prestar atención al principio de esterilidad al aislar el HASMC primario. Después de que los laboratorios PDMS y las membranas se tratan con plasma, las superficies no deben ensuciarse.
Sobre la base de este protocolo, las células endoteliales se pueden cocultivar con células musculares lisas y el estrés puro se puede dar a las células con tensión cíclica para simular aún más fuerzas mecánicas.
