Questo modello stimola gli stimoli biomeccanici sperimentati dalle cellule muscolari lisce nell'aorta umana. In combinazione con le cellule derivate dai pazienti, questo sistema può essere utilizzato per lo screening farmacologico e la medicina personalizzata delle malattie aortiche. Questo modello può imitare e controllare con precisione i parametri meccanici nudi delle cellule muscolari lisce nell'aorta umana, che fornisce una nuova piattaforma in vitro per lo studio e la patogenesi delle malattie aortiche.
A dimostrare la procedura sarà Mieradilijiang Abudubat, un medico poster del nostro laboratorio. Inizia lavando la regione laterale destra dell'aorta ascendente con pbs sterili, una o due volte. Rimuovere gli strati intimi e avventizi del tessuto con due pinze oftalmiche e mantenere lo strato di media per raccogliere le cellule.
Posizionare lo strato di supporto su un piatto di 10 centimetri e tagliarlo in pezzi da due a tre millimetri. Quindi, aggiungere cinque millilitri di SMCM contenente 10% fbs e 1% penicillina streptomicina ai campioni di tessuto. Spostare il piccolo tessuto nella bottiglia di coltura con un contagocce sterile, distribuendo il tessuto in modo uniforme.
Scartare il terreno di coltura il più possibile. Quindi capovolgere la bottiglia. Aggiungere due millilitri di SMCM nella bottiglia di coltura invertita e metterlo nell'incubatore con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per una o due ore.
Quindi giralo lentamente verso l'alto e aggiungi altri due millilitri di SMCM. Dopo cinque o sette giorni di incubazione, sostituire l'SMCM con quattro millilitri di SMCM fresco. Scartare lentamente e aggiungere l'SMCM quando si cambia il supporto.
Generalmente, le cellule muscolari lisce sporadiche si arrampicano in circa due settimane. Trasportare delicatamente il flacone di coltura quando ci si sposta verso una stazione di microscopio. Altrimenti, i tessuti galleggeranno e le cellule cresceranno lentamente.
Quando le cellule sono cresciute, dividerle in due nuove bottiglie di coltura con quattro millilitri di SMCM fresco. Identificare le cellule attraverso un'analisi di immunofluorescenza di quattro marcatori specifici per le cellule muscolari lisce. Per polimerizzare PDMS, aggiungere l'agente di polimerizzazione o il componente B alla base o al componente A e mescolare il complesso per cinque minuti.
Il volume dipenderà dalla necessità dello studio. Posizionare il gel PDMS preparato in un serbatoio di estrazione sottovuoto per 30-60 minuti e mantenere la pressione al di sotto di 0,8 milli pascal negativi. Utilizzando un software di progettazione assistita da computer, progettare lo stampo.
Su misura realizza gli stampi dei tre strati utilizzando una macchina per incisione a controllo numerico computerizzato ad alta precisione. Dopo aver ritagliato il telaio degli stampi e dei microcanali utilizzando lastre di PMMA, incollarle su un'altra piastra. Versare il gel PDMS preparato su uno stampo progettato.
Quindi cross-link a 70 gradi Celsius per una o due ore. Staccare le lastre PDMS reticolate dallo stampo e tagliare le membrane PDMS commercializzate in sezioni di 100 millimetri per 40 millimetri. Fori di perforazione sulle tre lastre PDM utilizzando un perforatore da un millimetro per rendere l'ingresso e l'uscita dell'aria e dei microcanali medi sul chip PDMS.
Trattare le tre lastre PDMS preparate e le due membrane PDMS con plasma di ossigeno per cinque minuti per l'attivazione superficiale del PDM. Impostare l'aria ambiente per il gas di processo, la pressione su 100 kilopascal negativi, la corrente su pilastri da 180 a 200 milliampere, la tensione su 200 volt e il tempo di elaborazione su cinque minuti. Incollare tre lastre PDMS e due membrane PDMS insieme sotto un microscopio stereoscopico, in modo tale che lo strato superiore sia costituito dalla lastra PDMS del canale dell'aria, quindi dalla membrana PDMS.
Il canale medio è costituito dalla lastra PDMS, quindi dalla membrana PDM e lo strato inferiore è la lastra PDMS del canale dell'aria. Posizionare il chip PDMS assemblato in un'incubatrice a 70 gradi Celsius per un'ora. Preparare diversi tubi in lattice di diametro interno di un millimetro e tre centimetri di lunghezza.
Inserire un diametro esterno di un millimetro e un ago di acciaio inossidabile lungo un centimetro in un'estremità del tubo preparato. Quindi inserire un'esca nell'altra estremità del tubo per creare il tubo collegato all'aria e ai microcanali medi del chip PDMS. Inserire i tubi preparati nelle uscite e nelle prese dell'aria e dei microcanali medi sul chip PDMS.
Infondere due millilitri di 80 milligrammi per millilitro di collagene di topo nel microcanale medio del chip PDM, utilizzando una siringa da due millilitri, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il collagene dal canale con una siringa da due millilitri. Posizionare i chip PDMS codificati al collagene in un'incubatrice a 60 gradi Celsius durante la notte.
Mettere i chip PDMS in uno sterilizzatore UV per più di un'ora. Posizionare i chip PDMS sterilizzati su un banco ultra pulito in preparazione per l'esperimento cellulare. Coltura quattro volte 10 alle cinque cellule muscolari lisce aortiche umane primarie da pazienti che utilizzano SMCM contenente 2% FBS e 1% penicillina streptomicina in un incubatore di anidride carbonica al 5%, fissato a 37 gradi Celsius.
Quando la densità delle cellule muscolari lisce raggiunge l'80% scartare l'SMCM e lavare le cellule con due millilitri di PPS. Digerire le cellule usando un millilitro di 0,25% tripsina per due minuti e centrifugare a 100 RCF per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di SMCM fresco.
Utilizzare otto millilitri di SMCM per coltivare le cellule su un piatto di coltura di 10 centimetri. Utilizzando un citometro, calcolare il numero di cellule e procedere con la concentrazione finale di due volte 10 alle cinque cellule per millilitro. Versare lentamente due millilitri di PBS nel microcanale medio del chip PDMS codificato e sterilizzato al collagene e successivamente scartare utilizzando una siringa da due millilitri.
Versare lentamente due millilitri di due volte 10 alle cinque cellule per millilitri di sospensione delle cellule muscolari lisce nel microcanale multimediale del chip PDMS. Quindi, chiudere l'esca all'ingresso e all'uscita del chip PDMS. Posizionare il chip PDMS in un'incubatrice, impostato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un giorno.
Dopo l'incubazione, quando le celle sono collegate alla membrana PDMS nel chip PDMS, collegare l'uscita del microcanale dell'aria sul chip PDMS al sistema di controllo del vuoto. Una forma cellulare normale allungata sarà vista al microscopio quando la cellula è attaccata. In contrasto con le celle rotonde sospese.
Accendere l'elettrovalvola e la pompa per vuoto. Aprire il regolatore del vuoto e regolare il livello di pressione in base alle deformazioni. Quindi, posizionare i chip PDMS e un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Preparare diverse elettrovalvole, filtri per vuoto, regolatori di vuoto, una pompa per vuoto, una pompa peristaltica e un PLC che controlla l'elettrovalvola. Programmare il controller PLC e impostare l'intervallo di tempo di spegnimento su un hertz. Collegare le elettrovalvole al controller programmato.
Collegare l'ingresso della pompa per vuoto ai filtri per vuoto, quindi collegare l'uscita dei filtri per vuoto ai regolatori del vuoto. Collegare l'uscita dei regolatori del vuoto alle elettrovalvole. E infine, collegare l'uscita delle elettrovalvole alle uscite dei microcanali dell'aria dei chip PDMS.
Collegare l'uscita della pompa peristaltica all'ingresso del microcanale medio del chip PDMS e l'ingresso della pompa peristaltica all'uscita del chip PDMS a microcanale medio per la sostituzione del terreno di coltura e la manipolazione del farmaco. Regolare l'ampiezza della deformazione dal regolatore e la frequenza di deformazione dal microcontrollore. La vitalità della linea cellulare umana di muscolo liscio aortico, CRL 1990, nel chip PDMS, è stata stimata utilizzando un test vivo e morto il terzo e il quinto giorno di coltura cellulare.
La vitalità cellulare è risultata superiore al 90% il terzo e il quinto giorno. La colorazione F-actina del citoscheletro di CRL 1990, nel chip PDMS, ha mostrato una normale morfologia cellulare e cellule allineate perpendicolarmente al ceppo dopo l'allungamento per 24 ore. L'immunofluorescenza dei marcatori contrattili SM22 e CNN1, era più alta in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni statiche.
Inoltre, i geni SM22 e CNN1 erano sovraregolati in condizioni di tensione delle cellule muscolari lisce. La colorazione F-actina di BAV e TAV, l'aneurisma dell'aorta toracica e la dissezione delle cellule muscolari lisce dell'aorta umana primaria derivate dal paziente, hanno mostrato una morfologia cellulare normale e cellule allineate perpendicolarmente alla direzione della deformazione dopo lo stiramento per 24 ore. La fluorescenza SM22 e CNN1 nell'aneurisma e nella dissezione dell'aorta toracica BAVTAAD e TAV è risultata più elevata in condizioni di sforzo rispetto a condizioni statiche.
Simile ai livelli di espressione genica di SM22 e CNN1, che erano anche up-regolati in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni statiche. Si dovrebbe prestare attenzione al principio di sterilità quando si isolano gli HASMC primari. Dopo che i laboratori PDMS e le membrane sono stati trattati con plasma, le superfici non devono essere sporcate.
Sulla base di questo protocollo, le cellule endoteliali possono essere co-coltivate con cellule muscolari lisce e lo stress puro può essere dato alle cellule con sforzo ciclico per simulare ulteriormente più forze meccaniche.
