בניית מודל של איבר-על-שבב של תא שריר חלק של אבי העורקים לשחזור זן ביומכני בדופן אבי העורקים

מודל זה מגרה גירויים ביו-מכניים שחווים תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי. בשילוב עם תאים שמקורם בחולים, מערכת זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות ורפואה מותאמת אישית של מחלות אבי העורקים. מודל זה יכול לחקות ולשלוט במדויק בפרמטרים המכניים החשופים של תאי השריר החלקים באבי העורקים האנושי, המספק פלטפורמה חדשנית במבחנה לחקר פתוגנזה של מחלות אבי העורקים.

המדגים את ההליך יהיה Mieradilijiang Abudubat, רופא פוסטר מהמעבדה שלנו. התחל על ידי שטיפת האזור הצדדי הימני של אבי העורקים העולה עם pbs סטרילי, פעם או פעמיים. הסר את שכבות האינטימה והאדוונטיטיה של הרקמה עם שני מלקחיים אופתלמיים ולשמור על שכבת המדיה כדי לקצור את התאים.

מניחים את שכבת המדיה על צלחת בגודל 10 ס"מ וחותכים אותה לשניים עד שלושה מילימטרים. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של SMCM המכיל 10% fbs ו 1% פניצילין סטרפטומיצין לדגימות הרקמה. מעבירים את הרקמה הקטנה לבקבוק התרבית עם טפטפת סטרילית, ומפזרים את הרקמה באופן שווה.

להשליך את מדיום התרבות ככל האפשר. ואז להפוך את הבקבוק הפוך. הוסיפו שני מיליליטר SMCM לבקבוק התרבית ההפוכה והכניסו אותו לחממה עם 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.

ואז לאט לאט להפוך אותו ימינה למעלה ולהוסיף עוד שני מיליליטר של SMCM. לאחר חמישה עד שבעה ימים של דגירה, להחליף את SMCM עם ארבעה מיליליטר של SMCM טרי. יש להשליך באיטיות ולהוסיף את ה-SMCM בעת החלפת המדיום.

באופן כללי, תאי שריר חלקים ספורדיים מטפסים החוצה תוך כשבועיים. העבירו את בקבוק התרבית בעדינות בעת המעבר לתחנת מיקרוסקופ. אחרת, הרקמות יצופו והתאים יגדלו לאט.

כאשר התאים גדלו, חלקו אותם לשני בקבוקי תרבית חדשים עם ארבעה מיליליטר של SMCM טרי. זהה את התאים באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי של ארבעה סמנים ספציפיים לתאי שריר חלק. כדי לפולימר PDMS, הוסף את חומר הריפוי או רכיב B לבסיס או לרכיב A וערבב את הקומפלקס במשך חמש דקות.

הנפח יהיה תלוי בצורך של המחקר. מניחים את ג'ל ה- PDMS המוכן במיכל מיצוי ואקום למשך 30 עד 60 דקות ושומרים על הלחץ מתחת לפסקל שלילי של 0.8 מילי. באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב, תכננו את התבנית.

בהתאמה אישית מייצרים את התבניות של שלוש השכבות באמצעות מכונת חריטה בעלת בקרה נומרית ממוחשבת ברמת דיוק גבוהה. לאחר גילוף מסגרת התבניות והמיקרו-ערוצים באמצעות לוחות PMMA, הדביקו אותם על צלחת אחרת. מוזגים את ג'ל PDMS המוכן על תבנית מעוצבת.

ואז להצליב קישור ב 70 מעלות צלזיוס במשך שעה עד שעתיים. מקלפים את לוחות ה-PDMS הצולבים מהתבנית וחותכים את ממברנות ה-PDMS הממוסחרות למקטעים של 100 מילימטר על 40 מילימטר. נקב חורים בשלושת לוחות ה-PDMs באמצעות מנקב חורים של מילימטר אחד כדי ליצור את הכניסה והיציאה של אוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים בשבב PDMS.

טפלו בשלושת לוחות ה-PDMS שהוכנו ובשני ממברנות ה-PDMS באמצעות פלזמת חמצן במשך חמש דקות להפעלת פני השטח של PDMs. הגדר את האוויר בחדר לעיבוד גז, לחץ ל-100 קילו-פסקל שליליים, זרם ל-180 עד 200 מיליאמפר מזחים, מתח ל-200 וולט וזמן עיבוד לחמש דקות. חברו שלושה לוחות PDMS ושני ממברנות PDMS יחד תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, כך שהשכבה העליונה מורכבת מלוח PDMS של ערוץ האוויר, ולאחר מכן מממברנת PDMS.

הערוץ הבינוני מורכב מלוח PDMS, ולאחר מכן ממברנת ה- PDMs, והשכבה התחתונה היא לוח PDMS של ערוץ האוויר. מניחים את שבב PDMS המורכב באינקובטור של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הכינו מספר צינורות לטקס בקוטר פנימי של מילימטר אחד ובאורך שלושה סנטימטרים.

הכנס מחט נירוסטה בקוטר של מילימטר אחד ובאורך סנטימטר אחד לקצה אחד של הצינור המוכן. לאחר מכן הכנס פיתיון לקצה השני של הצינור כדי ליצור את הצינור המחובר לאוויר ולמיקרו-ערוצים הבינוניים של שבב PDMS. הכנס את הצינורות המוכנים לתוך שקעים וכניסות של האוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים על שבב PDMS.

החדירו שני מיליליטרים של 80 מיליגרם למיליליטר של קולגן עכברים למיקרו-ערוץ הבינוני של שבב ה-PDMs, באמצעות מזרק של שני מיליליטר, ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את הקולגן מן הערוץ עם מזרק שני מיליליטר. הניחו את שבבי PDMS המקודדים בקולגן באינקובטור של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הכניסו את שבבי ה-PDMS למעקר UV למשך יותר משעה. הניחו את שבבי ה-PDMS המעוקרים על ספסל נקי במיוחד כהכנה לניסוי בתא. תרבית ארבע פעמים 10 לחמשת תאי השריר החלק של אבי העורקים האנושי העיקרי מחולים המשתמשים ב-SMCM המכילים 2%FBS ו-1% פניצילין סטרפטומיצין באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני, שנקבע על 37 מעלות צלזיוס.

כאשר צפיפות תאי השריר החלק מגיעה ל -80% להשליך את ה- SMCM, ולשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PPS. לעכל את התאים באמצעות מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין במשך שתי דקות וצנטריפוגה ב 100 RCF במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו להשעות את כדור התא במיליליטר אחד של SMCM טרי.

השתמש בשמונה מיליליטר של SMCM כדי לתרבת את התאים על צלחת תרבית בגודל 10 סנטימטרים. באמצעות ציטומטר, לחשב את מספר התא ולהמשיך עם הריכוז הסופי של פעמיים 10 עד חמשת התאים למיליליטר. יש לשפוך באיטיות שני מיליליטרים של PBS לתוך שבב PDMS המקודד והמעוקר במיקרו-ערוץ בינוני של קולגן ולאחר מכן להשליך באמצעות מזרק של שני מיליליטר.

שפכו באיטיות שני מיליליטרים של פעמיים 10 לחמשת התאים למיליליטר השעיית תאי שריר חלקים לתוך המיקרו-ערוץ המדיה של שבב PDMS. לאחר מכן, סגור את הפיתוי בכניסה וביציאה של שבב PDMS. מניחים את שבב PDMS באינקובטור, שנקבע ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ליום אחד.

לאחר הדגירה, כאשר התאים מחוברים לממברנת PDMS בשבב PDMS, חבר את מוצא המיקרו-ערוץ האוויר בשבב PDMS למערכת בקר הוואקום. צורה תאית נורמלית מוארכת תיראה מתחת למיקרוסקופ כאשר התא מחובר. בניגוד לתאים העגולים המרועים.

הפעל את שסתום הסולנואיד ואת משאבת הוואקום. פתחו את וסת הוואקום והתאימו את רמת הלחץ בהתאם לזנים. לאחר מכן, מניחים את שבבי PDMS ואינקובטור שנקבע ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות.

הכינו מספר שסתומי סולנואיד, מסנני ואקום, מווסתי ואקום, משאבת ואקום, משאבה פריסטלטית ו-PLC השולט בשסתום הסולנואיד. תכנת את בקר ה- PLC והגדר את מרווח הזמן הכבוי להרץ אחד. חבר את שסתומי הסולנואיד לבקר המתוכנת.

חבר את כניסת משאבת הוואקום למסנני הוואקום ולאחר מכן חבר את השקע של מסנני הוואקום לווסתי הוואקום. חבר את השקע של וסתי הוואקום לשסתומי סולנואידים. ולבסוף, חבר את השקע של שסתומי הסולנואיד לשקעים של מיקרו-ערוצים אוויר של שבבי PDMS.

חבר את היציאה של המשאבה הפריסטלטית לכניסה של המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS ואת הכניסה של המשאבה הפריסטלטית לשקע של שבב PDMS מיקרו-ערוצי בינוני להחלפת תרבית בינונית וטיפול בתרופות. התאם את המשרעת של המתח על ידי הרגולטור ואת תדר המתח על ידי בקר המיקרו. הכדאיות של קו תאי השריר החלק של אבי העורקים האנושי, CRL 1990, בשבב PDMS, הוערכה באמצעות בדיקה חיה ומתה ביום השלישי והחמישי של תרבית התאים.

כדאיות התאים נמצאה גבוהה מ-90% ביום השלישי וביום החמישי. צביעת F-אקטין של CRL 1990, בשבב PDMS, הראתה מורפולוגיה תקינה של תאים ותאים מיושרים בניצב לזן לאחר מתיחה במשך 24 שעות. אימונופלואורסצנציה של הסמנים המתכווצים SM22 ו- CNN1, הייתה גבוהה יותר בתנאי מאמץ בהשוואה לתנאים הסטטיים.

כמו כן, הגנים SM22 ו-CNN1 היו מווסתים בתנאי מאמץ של תאי שריר חלקים. צביעת F-actin של BAV ו- TAV, מפרצת אבי העורקים החזי ודיסקציה של תאי שריר חלק אבי העורקים האנושי העיקרי שמקורו בחולה, הראו מורפולוגיה תקינה של תאים ותאים מיושרים בניצב לכיוון המתח לאחר מתיחה במשך 24 שעות. הפלואורסצנטיות של SM22 ו-CNN1 במפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי BAVTAAD ו-TAV היו גבוהות יותר בתנאי מאמץ מאשר בתנאים סטטיים.

בדומה לרמות ביטוי הגנים של SM22 ו-CNN1, שגם הן היו מווסתות בתנאי מאמץ בהשוואה לתנאים סטטיים. יש לשים לב לעקרון הסטריליות בעת בידוד HASMC ראשוני. לאחר שמעבדות PDMS והממברנות מטופלות בפלזמה, אין ללכלך את המשטחים.

בהתבסס על פרוטוקול זה, תאי אנדותל יכולים להיות בתרבית משותפת עם תאי שריר חלק ואת הלחץ העצום ניתן לתת לתאים עם מאמץ מחזורי כדי לדמות עוד יותר כוחות מכניים.