Bu model, insan aortunda düz kas hücrelerinin yaşadığı biyomekanik uyaranları uyarır. Hasta kaynaklı hücrelerle birleştirilen bu sistem, ilaç taraması ve aort hastalıklarının kişiselleştirilmiş tıbbı için kullanılabilir. Bu model, insan aortundaki düz kas hücrelerinin çıplak mekanik parametrelerini taklit edebilir ve hassas bir şekilde kontrol edebilir, bu da aort hastalıklarının incelenmesi ve patogenezi için yeni bir in vitro platform sağlar.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir poster doktoru olan Mieradilijiang Abudubat'tır. Yükselen aortun sağ lateral bölgesini steril pbs ile bir veya iki kez yıkayarak başlayın. İki oftalmik forseps ile dokunun intima ve adventitia katmanlarını çıkarın ve hücreleri toplamak için medya tabakasını koruyun.
Medya katmanını 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin ve iki ila üç milimetrelik parçalar halinde kesin. Daha sonra, doku örneklerine % 10 fbs ve% 1 penisilin streptomisin içeren beş mililitre SMCM ekleyin. Küçük dokuyu steril bir damlalıkla kültür şişesine taşıyın ve dokuyu eşit şekilde yayın.
Kültür ortamını mümkün olduğunca atın. Sonra şişeyi baş aşağı çevirin. Ters çevrilmiş kültür şişesine iki mililitre SMCM ekleyin ve bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübatöre yerleştirin.
Sonra yavaşça sağa doğru çevirin ve iki mililitre SMCM daha ekleyin. Beş ila yedi günlük inkübasyondan sonra, SMCM'yi dört mililitre taze SMCM ile değiştirin. Ortamı değiştirirken SMCM'yi yavaşça atın ve ekleyin.
Genel olarak, sporadik düz kas hücreleri yaklaşık iki hafta içinde dışarı çıkar. Bir mikroskop istasyonuna giderken kültür şişesini nazikçe taşıyın. Aksi takdirde, dokular yüzer ve hücreler yavaşça büyür.
Hücreler büyüdüğünde, onları dört mililitre taze SMCM içeren iki yeni kültür şişesine bölün. Düz kas hücreleri için dört spesifik belirtecin immünofloresan analizi yoluyla hücreleri tanımlayın. PDMS'yi polimerize etmek için, kürleme maddesini veya B bileşenini tabana veya A bileşenine ekleyin ve kompleksi beş dakika boyunca karıştırın.
Hacim, etüdün ihtiyacına bağlı olacaktır. Hazırlanan PDMS jelini 30 ila 60 dakika boyunca bir vakum ekstraksiyon tankına yerleştirin ve basıncı negatif 0,8 mili pascal'ın altında tutun. Bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanarak kalıbı tasarlayın.
Özel, yüksek hassasiyetli bir bilgisayar sayısal kontrol gravür makinesi kullanarak üç katmanın kalıplarını yapın. PMMA plakalarını kullanarak kalıpların ve mikro kanalların çerçevesini oyduktan sonra, bunları başka bir plakaya yapıştırın. Hazırlanan PDMS jelini tasarlanmış bir kalıba dökün.
Daha sonra bir ila iki saat boyunca 70 santigrat derecede çapraz bağlayın. Çapraz bağlı PDMS plakalarını kalıptan çıkarın ve ticarileştirilmiş PDMS membranlarını 100 milimetre x 40 milimetrelik kesitler halinde kesin. PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların giriş ve çıkışını yapmak için bir milimetrelik delik delici kullanarak üç PDM plakasındaki delikleri delin.
PDM'lerin yüzey aktivasyonu için hazırlanan üç PDMS levhasını ve iki PDMS membranını beş dakika boyunca oksijen plazma ile tedavi edin. Oda havasını gazı işlemeye, basıncı negatif 100 kilopaskal, akımı 180 ila 200 miliamper iskeleye, voltajı 200 volta ve işlem süresini beş dakikaya ayarlayın. Üç PDMS levhayı ve iki PDMS membranını stereoskopik bir mikroskop altında birbirine bağlayın, böylece üst tabaka hava kanalı PDMS levhasından, ardından PDMS membranından oluşur.
Orta kanal PDMS levhadan, daha sonra PDM'lerin membranından oluşur ve alt katman hava kanalı PDMS levhasıdır. Monte edilen PDMS çipini bir saat boyunca 70 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Birkaç milimetre iç çap ve üç santimetre uzunluğunda lateks hortum hazırlayın.
Hazırlanan hortumun bir ucuna bir milimetre dış çap ve bir santimetre uzunluğunda paslanmaz çelik iğne yerleştirin. Ardından, PDMS çipinin havasına ve orta mikro kanallarına bağlı tüpü oluşturmak için hortumun diğer ucuna bir cazibe yerleştirin. Hazırlanan tüpleri PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların çıkışlarına ve girişlerine yerleştirin.
İki mililitrelik bir şırınga kullanarak, mililitre fare kolajeni başına iki mililitre 80 miligram fare kolajenini PDM çipinin orta mikro kanalına uygulayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kollajeni kanaldan iki mililitrelik bir şırınga ile çıkarın. Kollajen kodlu PDMS yongalarını gece boyunca 60 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.
PDMS yongalarını bir saatten fazla bir süre UV sterilizatörüne yerleştirin. Sterilize edilmiş PDMS çiplerini, hücre deneyine hazırlık olarak ultra temiz bir tezgaha yerleştirin. 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir karbondioksit inkübatöründe% 2 FBS ve% 1 penisilin streptomisin içeren SMCM kullanan hastalardan beş birincil insan aort düz kas hücresine dört kez 10 kez kültür.
Düz kas hücresi yoğunluğu% 80'e ulaştığındaSMCM'yi atın ve hücreleri iki mililitre PPS ile yıkayın. Hücreleri iki dakika boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin kullanarak sindirin ve beş dakika boyunca 100 RCF'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre taze SMCM'de yeniden askıya alın.
Hücreleri 10 santimetrelik bir kültür kabında kültürlemek için sekiz mililitre SMCM kullanın. Bir sitometre kullanarak, hücre sayısını hesaplayın ve mililitre başına beş hücreye iki kez 10 nihai konsantrasyonla devam edin. Kollajen kodlu ve sterilize edilmiş PDMS çip orta mikro kanalına yavaşça iki mililitre PBS dökün ve daha sonra iki mililitrelik bir şırınga kullanarak atın.
PDMS çipinin ortam mikrokanalına mililitre düz kas hücresi süspansiyonu başına beş hücreye iki kez 10 oranında iki mililitre yavaşça dökün. Ardından, PDMS yongasının giriş ve çıkışındaki cazibeyi kapatın. PDMS çipini bir gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
Kuluçkadan sonra, hücreler PDMS çipindeki PDMS membranına bağlandığında, PDMS çipi üzerindeki hava mikrokanalının çıkışını vakum kontrol sistemine bağlayın. Hücre bağlandığında mikroskop altında uzatılmış normal bir hücresel form görülecektir. Asılı yuvarlak hücrelerle tezat oluşturuyor.
Solenoid valfi ve vakum pompasını açın. Vakum regülatörünü açın ve gerinimlere bağlı olarak basınç seviyesini ayarlayın. Ardından, PDMS yongalarını ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörü yerleştirin.
Birkaç solenoid valf, vakum filtreleri, vakum regülatörleri, bir vakum pompası, bir peristaltik pompa ve solenoid valfi kontrol eden bir PLC hazırlayın. PLC kontrolörünü programlayın ve açma zaman aralığını bir hertz'e ayarlayın. Solenoid valfleri programlanmış kontrolöre bağlayın.
Vakum pompasının girişini vakum filtrelerine bağlayın ve ardından vakum filtrelerinin çıkışını vakum regülatörlerine bağlayın. Vakum regülatörlerinin çıkışını solenoid valflere bağlayın. Son olarak, solenoid valflerin çıkışını PDMS yongalarının hava mikrokanallarının çıkışlarına bağlayın.
Kültür ortamı değişimi ve ilaç kullanımı için peristaltik pompanın çıkışını PDMS çipinin orta mikrokanalının girişine ve peristaltik pompanın girişini orta mikrokanal PDMS çipinin çıkışına bağlayın. Gerinimin genliğini regülatör tarafından ve gerinim frekansını mikro denetleyici ile ayarlayın. PDMS çipinde insan aort düz kas hücre hattının yaşayabilirliği, CRL 1990, hücre kültürünün üçüncü ve beşinci gününde canlı ve ölü bir tahlil kullanılarak tahmin edildi.
Hücre canlılığı, üçüncü gün ve beşinci günde% 90'dan daha yüksek bulundu. PDMS çipinde CRL 1990'ın sitoiskelet F-aktin boyaması, normal hücre morfolojisini ve hücrelerin 24 saat gerildikten sonra suşa dik olarak hizalandığını gösterdi. Kasılma belirteçleri SM22 ve CNN1'in immünofloresansı, statik koşullara kıyasla gerinim koşulları altında daha yüksekti.
Ayrıca, SM22 ve CNN1 genleri, düz kas hücrelerinin gerilme koşullarında yukarı regüle edildi. BAV ve TAV'ın F-aktin boyaması, torasik aort anevrizması ve hasta kaynaklı primer insan aort düz kas hücrelerinin diseksiyonu, normal hücre morfolojisi ve hücrelerin 24 saat gerildikten sonra gerilme yönüne dik olarak hizalandığını gösterdi. BAVTAAD ve TAV torasik aort anevrizması ve diseksiyonunda SM22 ve CNN1 floresansı gerilme koşullarında statik koşullara göre daha yüksekti.
SM22 ve CNN1'in gen ekspresyon seviyelerine benzer şekilde, statik koşullara kıyasla gerinim koşullarında da yukarı regüle edilmiştir. Birincil HASMC'yi izole ederken sterilite ilkesine dikkat edilmelidir. PDMS laboratuvarları ve membranlar plazma ile muamele edildikten sonra, yüzeyler kirlenmemelidir.
Bu protokole dayanarak, endotel hücreleri düz kas hücreleri ile birlikte kültürlenebilir ve daha fazla mekanik kuvveti daha fazla simüle etmek için siklik gerinimli hücrelere saf stres verilebilir.
