يوفر نظام فحص النسخ في المختبر ل Borreliella burgdorferi أداة كيميائية حيوية للباحثين لدراسة الآليات التنظيمية الجينية والعوامل التي تحكم النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي. يسمح لنا النظام باختبار كيفية تأثير عوامل النسخ والعوامل المساعدة وتركيزات الملح ودرجة الحموضة على وظيفة بوليميراز Borreliella burgdorferi RNA ، مما يساهم في فهمنا العام للآليات التنظيمية للجينات. يمكن أن تسمح لنا هذه التقنية القوية أيضا بفحص الأدوية التي تثبط بوليميراز الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي ، مما يفتح الباب أمام تطوير عقاقير جديدة لعلاج داء لايم.
للبدء ، اجمع حبيبات الخلية من لترين إلى أربعة لترات من Borreliella burgdorferi RpoC-His10X المستزرعة في وسط BSKII في بيئة محبة للهواء الدقيقة بكثافة تتراوح من اثنين إلى أربعة أضعاف 10 ثابت لكل ملليلتر. بيليه الخلايا في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في زجاجات الطرد المركزي 500 ملليلتر وتجاهل طاف. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 30 ملليلتر من المخزن المؤقت HN المثلج البارد ، وكرر خطوة الطرد المركزي ، وصب المادة الطافية.
أثناء العمل ، حافظ على الخلايا وتحلل البروتينات وتنقيتها عند أربع درجات مئوية أو على الجليد ما لم يتم تجميدها. حافظ على بوليميراز الحمض النووي الريبي في بيئة مختزلة عن طريق إضافة ديثيوثريتول طازج بتركيز 2 مليمولار إلى كل مخزن مؤقت مستخدم والحفاظ على درجة الحموضة 8.0. تحضير المحللة من بيليه خلية Borreliella burgdorferi باستخدام مجموعة تحلل البكتيريا التجارية.
أعد تعليق الحبيبات في 10 إلى 15 ملليلتر من محلول B-PER بدون مثبط الأنزيم البروتيني واترك التحلل يستمر لمدة خمس دقائق على الجليد. أضف كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني إلى محلول التحلل واستمر في ثلاث جولات من صوتنة. الآن قم بتوضيح تحلل الخلية عن طريق الطرد المركزي والترشيح باستخدام أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.
أضف المخزن المؤقت لتحميل عمود الكوبالت إلى المحلول ، مما يجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 30 ملليلتر. بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20،000 مرة G لمدة 30 دقيقة. في وقت لاحق ، قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر وقم بتخفيف المخزن المؤقت لتحميل عمود المحللة والكوبالت إلى نسبة تخفيف نهائية تبلغ 1:10.
قم بإجراء كروماتوغرافيا التقارب على طافت محللات الخلية الموضحة باستخدام عمود راتنج الكوبالت أو النيكل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. احفظ العينات المتدفقة والغسيل والمستخلصة للتحليل. استبدل على الفور محلول محلول بوليميراز الحمض النووي الريبي بمحلول المخزن المؤقت للتخزين باستخدام عمود تبادل المخزن المؤقت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
بعد ذلك ، ركز بوليميراز الحمض النووي الريبي بتركيز 0.2 إلى 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي ذات القطع 10 كيلو دالتون. تحديد التركيز بواسطة مقياس الطيف الضوئي وإعداد مخزون التجميد. أحجام Aliquot من 20 إلى 50 ميكرولتر من مخزون تجميد بوليميراز الحمض النووي الريبي في أنابيب PCR وتخزين بوليميراز الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإعداد أسطح العمل ، بما في ذلك مقعد الإشعاع ، لتقليل التلوث الإشعاعي. قم بإذابة مخزون بوليميراز الحمض النووي الريبي الطازج و RpoD على الثلج واخلط جميع المخزونات المجمدة المذابة جيدا قبل سحب العينات قم بإعداد خليط تفاعل رئيسي في خليط NTP منفصل للنيوكليوتيدات ذات العلامات المشعة وفقا للمتطلبات التجريبية. توزيع تفاعلات التحكم في مجموعات تجريبية في أنابيب PCR.
بعد توزيع الماء ، ومزيج التفاعل ، وبوليميراز الحمض النووي الريبي ، و RpoD في أنابيب PCR المخصصة ، امزج الكواشف عن طريق الماصة. انقل المواد المحضرة إلى مقعد إشعاعي ، وأضف ATP المسمى alpha-32P إلى NTP ، واخلطها عن طريق سحب لطيف. أضف NTP إلى الأنابيب التي تحتوي على مخاليط تفاعل النسخ في المختبر وابدأ تفاعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة قالب الحمض النووي.
امزج حجم التفاعل عن طريق سحب الأنابيب برفق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية. قم بإزالة التفاعلات من جهاز التدوير الحراري أو الكتلة الحرارية وأوقف تفاعلات النسخ في المختبر عن طريق إضافة حجم متساو من صبغة تحميل 2X RNA تحتوي على 50٪ فورماميد إلى خليط التفاعل. تشوه الإنزيمات عن طريق احتضان التفاعلات عند 65 درجة سلزية لمدة خمس دقائق في دورة حرارية أو كتلة حرارية.
باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، افصل الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر في 10٪ إلى 15٪ TBE من مواد البولي أكريلاميد البوليكريلاميد من اليوريا عند 180 فولت لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد إزالة أي جزء من الجل يحتوي على ATP غير مدمج مشع ، قم بتعريض الجل لشاشة الفوسفو طوال الليل وقم بتصوير الحمض النووي الريبي المشع باستخدام جهاز تصوير فسفوغرافيك. أظهر SDS-PAGE ثلاثة نطاقات تقابل ثلاثة ببتيدات ، RpoC ، RpoB ، و RpoA لمركب بوليميراز الحمض النووي الريبي.
كما لوحظ وجود ببتيد من 115 كيلودالتون يطابق حجم Borreliella burgdorferi RpoD المؤتلف الموسوم ب MBP. أدى انشقاق خليط البروتين مع عامل البروتياز XA إلى توليد منتجين مهمين ، RpoD و MBP. تم إنشاء موقع المروج ل Borreliella burgdorferi FLGB بواسطة PCR.
يؤدي التخفيف المزدوج لتركيز RpoD إلى انخفاض مستوى منتج الحمض النووي الريبي المتراكم. يعطي تركيز بوليميراز الحمض النووي الريبي المنخفض عددا أقل من منتجات الحمض النووي الريبي عبر نطاق تركيزات RpoD. أشارت إشارة قياس الكثافة إلى وجود علاقة خطية بين كمية RpoD الموجودة في التفاعل في كلتا التجربتين.
النشاط الأنزيمي لبوليميراز الحمض النووي الريبي حساس لمجموعة متنوعة من العوامل أثناء عملية التنقية والتخزين والتجريبية. تعطي الإنزيمات والكواشف الطازجة ، إلى جانب التخطيط الجيد ، أفضل فرصة ممكنة للنجاح في هذا البروتوكول.
