Borreliella burgdorferi için in vitro transkripsiyon tahlil sistemi, araştırmacıların gen düzenleyici mekanizmaları ve RNA polimerazın enzimatik aktivitesini yöneten faktörleri incelemeleri için biyokimyasal bir araç sağlar. Sistem, transkripsiyon faktörlerinin, ko-faktörlerin, tuz konsantrasyonlarının ve pH'ın Borreliella burgdorferi RNA polimeraz fonksiyonunu nasıl etkilediğini test etmemizi sağlar ve bu da gen düzenleyici mekanizmalar hakkındaki genel anlayışımıza katkıda bulunur. Bu güçlü teknik, RNA polimerazı seçici olarak inhibe eden ilaçları taramamıza izin verebilir ve Lyme borreliosis'i tedavi etmek için yeni ilaçlar geliştirmenin kapısını açabilir.
Başlamak için, hücre peletini mikroaerofilik bir ortamda BSKII ortamında kültürlenmiş iki ila dört litre Borreliella burgdorferi RpoC-His10X'ten, mililitre başına iki ila dört kat 10 sabit yoğunluğa kadar toplayın. Hücreleri 500 mililitre santrifüjlü şişelerde dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 kez G'de pelet yapın ve süpernatanı atın. Ardından, hücreleri 30 mililitre buz gibi soğuk HN tamponunda yeniden askıya alın, santrifüjleme adımını tekrarlayın ve süpernatanı boşaltın.
Çalışırken, donmadıkça hücreleri, lizatı ve saflaştırılmış proteinleri dört santigrat derecede veya buz üzerinde tutun. Kullanılan her tampona iki milimolar konsantrasyonda taze hazırlanmış ditiyotreitol ekleyerek RNA polimerazı indirgeyici bir ortamda tutun ve pH 8.0'ı koruyun. Ticari bir bakteriyel lizis kiti kullanarak Borreliella burgdorferi hücre peletinden lizat hazırlayın.
Pelet, proteaz inhibitörü olmadan 10 ila 15 mililitre B-PER çözeltisinde tekrar askıya alın ve lizisin buz üzerinde beş dakika ilerlemesine izin verin. Lizis çözeltisine bir proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin ve üç tur sonikasyon ile devam edin. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü kullanarak santrifüjleme ve filtreleme ile hücre lizatını netleştirin.
Çözeltiye kobalt kolon yükleme tamponu ekleyerek toplam hacmi 30 mililitreye kadar çıkarır. Hücre enkazını 30 dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleme ile pelet edin. Daha sonra, süpernatantı 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve lizat ve kobalt kolon yükleme tamponunu 1:10'luk bir nihai seyreltme oranına kadar seyreltin.
Üreticinin talimatlarını izleyerek bir kobalt veya nikel reçine sütunu kullanarak arıtılmış hücre lizat süpernatant üzerinde afinite kromatografisi yapın. Akış, yıkama ve elütlenmiş numuneleri analiz için saklayın. RNA polimeraz çözeltisi tampon çözeltisini, üreticinin talimatlarını izleyerek bir tampon değişim sütunu kullanarak depolama tampon çözeltisi ile hemen değiştirin.
Daha sonra, RNA polimerazını, 10 kilodaltonluk kesme santrifüj filtre üniteleri kullanarak mililitre başına 0.2 ila 0.4 miligramlık bir konsantrasyona konsantre edin. Konsantrasyonu spektrofotometre ile belirleyin ve donma stoklarını hazırlayın. PCR tüplerinde 20 ila 50 mikrolitre hacimde RNA polimeraz stoklarını dondurun ve RNA polimerazı eksi 80 santigrat derecede depolayın.
Radyasyon kontaminasyonunu azaltmak için radyasyon tezgahı da dahil olmak üzere çalışma yüzeylerini hazırlayın. Taze RNA polimeraz ve RpoD stoklarını buz üzerinde çözün ve pipetlemeden önce çözülmüş tüm dondurulmuş stokları iyice karıştırın Deneysel gereksinimlere göre radyoaktif işaretli nükleotidler için ayrı bir NTP karışımında bir ana reaksiyon karışımı hazırlayın. Kontrol reaksiyonlarını deney setlerinde PCR tüplerine dağıtın.
Su, reaksiyon karışımı, RNA polimeraz ve RpoD'yi belirlenmiş PCR tüplerine dağıttıktan sonra, reaktifleri pipetleme ile karıştırın. Hazırlanan malzemeleri bir radyasyon tezgahına aktarın, NTP'ye alfa-32P etiketli ATP ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın. İn vitro transkripsiyon reaksiyonu karışımlarını içeren tüplere NTP ekleyin ve bir DNA şablonu ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonunu başlatın.
Reaksiyon hacmini nazikçe pipetleyerek karıştırın ve tüpleri bir termosiklet veya ısı bloğunda beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Reaksiyonları termosiklerden veya ısı bloğundan çıkarın ve reaksiyon karışımına% 50 formamid içeren eşit hacimde 2X RNA yükleme boyası ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonlarını durdurun. Bir termosiklet veya ısı bloğunda beş dakika boyunca 65 santigrat derecede reaksiyonları inkübe ederek enzimlerin denatürasyonu.
Jel elektroforezi kullanarak, in vitro transkribe RNA'yı% 10 ila% 15 TBE üre poliakrilamid jellerinde 180 voltta 30 ila 45 dakika boyunca ayırın. Dahil edilmemiş radyoaktif etiketli ATP içeren jelin herhangi bir bölümünü çıkardıktan sonra, jeli bir gecede fosfo ekrana maruz bırakın ve bir fosfoekran görüntüleyici kullanarak radyoaktif etiketli RNA'yı görüntüleyin. SDS-PAGE, RNA polimeraz kompleksinin üç peptidine, RpoC, RpoB ve RpoA'ya karşılık gelen üç bant gösterdi.
MBP etiketli rekombinant Borreliella burgdorferi RpoD'nin boyutuna uyan 115 kilodaltonluk bir peptit de gözlendi. Protein karışımının faktör XA proteaz ile bölünmesi, iki önemli ürünün, RpoD ve MBP'nin üretilmesine yol açtı. Borreliella burgdorferi FLGB'nin promotör sitesi PCR tarafından oluşturulmuştur.
RpoD konsantrasyonunun iki kat seyreltilmesi, biriken RNA ürününün daha düşük bir seviyesine yol açar. Düşük RNA polimeraz konsantrasyonu, RpoD konsantrasyonları aralığında daha az RNA ürünü verir. Dansitometri sinyali, her iki deneyde de reaksiyonda bulunan RpoD miktarı arasında doğrusal bir ilişki olduğunu gösterdi.
RNA polimeraz enzimatik aktivitesi, saflaştırma, depolama ve deneysel işlem sırasında çeşitli faktörlere duyarlıdır. Taze enzim ve reaktifler, iyi planlama ile birlikte, bu protokolde mümkün olan en iyi başarı şansını verir.
