O sistema de ensaio de transcrição in vitro para Borreliella burgdorferi fornece uma ferramenta bioquímica para investigadores estudarem mecanismos e fatores regulatórios gênicos que governam a atividade enzimática da RNA polimerase. O sistema nos permite testar como fatores de transcrição, cofatores, concentrações de sal e pH afetam a função da RNA polimerase da Borreliella burgdorferi, o que contribui para nossa compreensão geral dos mecanismos de regulação gênica. Esta técnica poderosa também pode nos permitir rastrear drogas que inibem seletivamente a RNA polimerase, abrindo as portas para o desenvolvimento de novas drogas para tratar a borreliose de Lyme.
Para começar, colete o pellet celular de dois a quatro litros de Borreliella burgdorferi RpoC-His10X cultivado em meio BSKII em ambiente microaerofílico a uma densidade de duas a quatro vezes 10 constantes por mililitros. Pastilha as células a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius em frascos centrífugos de 500 mililitros e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em 30 mililitros de tampão HN gelado, repita a etapa de centrifugação e decante o sobrenadante.
Enquanto trabalha, mantenha as células, lisadas e proteínas purificadas a quatro graus Celsius ou no gelo, a menos que congelem. Manter a RNA polimerase em um ambiente redutor adicionando ditiotreitol recém-preparado em uma concentração de dois milimolares a cada tampão usado e manter o pH 8,0. Preparar lisado a partir do pellet de células de Borreliella burgdorferi usando um kit comercial de lise bacteriana.
Ressuspender o pellet em 10 a 15 mililitros de solução de B-PER sem inibidor de protease e deixar a lise prosseguir por cinco minutos em gelo. Adicione um coquetel de inibidor de protease à solução de lise e prossiga com três rodadas de sonicação. Agora esclareça o lisado celular por centrifugação e filtração usando um tubo centrífugo de 50 mililitros.
Adicione o tampão de carregamento da coluna de cobalto à solução, tornando o volume total de até 30 mililitros. Pellet os restos celulares por centrifugação a 20.000 vezes G por 30 minutos. Em seguida, filtrar o sobrenadante usando um filtro de seringa de 0,45 micrômetro e diluir o tampão de carregamento de lisado e coluna de cobalto até uma proporção de diluição final de 1:10.
Realizar cromatografia de afinidade no sobrenadante de lisado celular clarificado usando uma coluna de resina de cobalto ou níquel seguindo as instruções do fabricante. Guarde as amostras de fluxo, lavagem e eluídas para análise. Troque imediatamente a solução tampão de solução de RNA polimerase pela solução tampão de armazenamento usando uma coluna de troca de buffer seguindo as instruções do fabricante.
Em seguida, concentre a RNA polimerase em uma concentração de 0,2 a 0,4 miligrama por mililitro usando unidades de filtro centrífugo de corte de 10 quilodaltons. Determinar a concentração por espectrofotômetro e preparar os estoques de congelamento. Alíquota 20 a 50 microlitros de estoques de congelamento de RNA polimerase em tubos de PCR e armazene a RNA polimerase a menos 80 graus Celsius.
Preparar as superfícies de trabalho, incluindo a bancada de radiação, para reduzir a contaminação por radiação. Descongelar os estoques frescos de RNA polimerase e RpoD no gelo e misturar todos os estoques congelados descongelados completamente antes da pipetagem Prepare uma mistura mestre de reação em uma mistura NTP separada para nucleotídeos radiomarcados de acordo com os requisitos experimentais. Dispensar as reações de controle em conjuntos experimentais em tubos de PCR.
Depois de dispensar água, mistura de reação, RNA polimerase e RpoD em tubos de PCR designados, misture os reagentes por pipetagem. Transfira os materiais preparados para uma bancada de radiação, adicione ATP marcado com alfa-32P ao NTP e misture por pipetagem suave. Adicionar NTP aos tubos contendo as misturas de reação de transcrição in vitro e iniciar a reação de transcrição in vitro adicionando um molde de DNA.
Misture o volume de reação pipetando suavemente e incube os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador ou bloco de calor. Remova as reações do termociclador ou bloco de calor e interrompa as reações de transcrição in vitro adicionando um volume igual de corante de carregamento de RNA 2X contendo 50% de formamida à mistura de reação. Desnaturação das enzimas incubando reações a 65 graus Celsius por cinco minutos em um termociclador ou bloco de calor.
Por eletroforese em gel, separar o RNA transcrito in vitro em géis de ureia de poliacrilamida de 10% a 15% TBE a 180 volts por 30 a 45 minutos. Depois de remover qualquer porção do gel contendo ATP radiomarcado não incorporado, exponha o gel à tela fosfogênica durante a noite e obtenha imagens do RNA radiomarcado usando um imageador fosfoscreen. O SDS-PAGE apresentou três bandas correspondentes a três peptídeos, RpoC, RpoB e RpoA do complexo RNA polimerase.
Um peptídeo de 115 quilodaltons correspondente ao tamanho da RpoD recombinante de Borreliella burgdorferi marcada com MBP também foi observado. A clivagem da mistura proteica com protease do fator XA levou à geração de dois produtos significativos, RpoD e MBP. O sítio promotor de Borreliella burgdorferi FLGB foi gerado por PCR.
Uma diluição dupla da concentração de RpoD dá origem a um nível mais baixo do produto de RNA acumulado. Uma baixa concentração de RNA polimerase fornece menos produtos de RNA em toda a faixa de concentrações de RpoD. O sinal densitométrico indicou uma relação linear entre a quantidade de RpoD presente na reação em ambos os experimentos.
A atividade enzimática da RNA polimerase é sensível a uma variedade de fatores durante a purificação, armazenamento e processo experimental. Enzimas e reagentes frescos, juntamente com um bom planejamento, dão a melhor chance possível de sucesso neste protocolo.
