מערכת בדיקת השעתוק במבחנה עבור Borreliella burgdorferi מספקת כלי ביוכימי לחוקרים לחקור מנגנוני בקרה גנטיים וגורמים השולטים בפעילות האנזימטית של RNA פולימראז. המערכת מאפשרת לנו לבחון כיצד גורמי שעתוק, קו-פקטורים, ריכוזי מלחים ו-pH משפיעים על תפקוד ה-RNA פולימראז Borreliella burgdorferi, מה שתורם להבנה הכוללת שלנו של מנגנוני בקרת גנים. טכניקה רבת עוצמה זו יכולה גם לאפשר לנו לסנן תרופות המעכבות באופן סלקטיבי RNA פולימראז, ולפתוח את הדלת לפיתוח תרופות חדשניות לטיפול בבורליוזיס ליים.
כדי להתחיל, לאסוף את גלולת התא מ שניים עד ארבעה ליטר של Borreliella burgdorferi RpoC-His10X תרבית בתווך BSKII בסביבה microaerophilic לצפיפות של שניים עד ארבעה פעמים 10 קבוע למיליליטר. גלולה את התאים ב 10, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בבקבוקים צנטריפוגליים 500 מיליליטר ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים ב -30 מיליליטר של חיץ HN קר כקרח, חזור על שלב הצנטריפוגה, ונטרל את הסופרנטנט.
תוך כדי עבודה, שמרו על התאים, הליזט והחלבונים המטוהרים בארבע מעלות צלזיוס או על קרח אלא אם כן הם קופאים. שמור על RNA פולימראז בסביבה מפחיתה על ידי הוספת dithiothreitol טרי מוכן בריכוז של שני מילימולר לכל חיץ בשימוש ולשמור על pH 8.0. הכינו ליזט מכדורית התא Borreliella burgdorferi באמצעות ערכת ליזה חיידקית מסחרית.
השהה מחדש את הגלולה ב 10 עד 15 מיליליטר של תמיסת B-PER ללא מעכב פרוטאז ואפשר לליזה להמשיך במשך חמש דקות על קרח. הוסיפו קוקטייל מעכב פרוטאז לתמיסת הליזיס והמשיכו בשלושה סבבים של סוניקציה. כעת להבהיר את התא ליזט על ידי צנטריפוגה וסינון באמצעות צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
הוסף מאגר טעינת עמודת קובלט לתמיסה, והפוך את הנפח הכולל לעד 30 מיליליטר. גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 30 דקות. לאחר מכן, מסננים את הסופרנאטנט באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ומדללים את מאגר העמסת עמוד הליזט והקובלט ליחס דילול סופי של 1:10.
בצע כרומטוגרפיית זיקה על הסופרנאטנט ליזט התא המובהר באמצעות עמודת שרף קובלט או ניקל בהתאם להוראות היצרן. שמור את הדגימות הזורמות, השטיפה והמדוללות לצורך ניתוח. החלף באופן מיידי את תמיסת החיץ של תמיסת RNA פולימראז בתמיסת מאגר האחסון באמצעות עמודת החלפת מאגר בהתאם להוראות היצרן.
לאחר מכן, רכז את ה-RNA פולימראז לריכוז של 0.2 עד 0.4 מיליגרם למיליליטר באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות בחיתוך 10 קילו-דלטון. לקבוע את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ולהכין את מלאי ההקפאה. Aliquot 20 עד 50 מיקרוליטר נפחים של RNA פולימראז הקפאת מלאי בצינורות PCR ולאחסן את RNA פולימראז במינוס 80 מעלות צלזיוס.
הכינו את משטחי העבודה, כולל ספסל הקרינה, להפחתת זיהום קרינה. הפשירו RNA פולימראז טרי ומלאי RpoD על קרח וערבבו היטב את כל המלאים הקפואים המופשרים לפני הפיפטינג הכינו תערובת תגובת אב בתערובת NTP נפרדת לנוקלאוטידים מסומנים ברדיו בהתאם לדרישות הניסוי. לחלק את תגובות הבקרה בקבוצות ניסוי לתוך צינורות PCR.
לאחר ניפוק מים, תערובת תגובה, RNA פולימראז ו- RpoD לצינורות PCR ייעודיים, מערבבים את הריאגנטים על ידי פיפטציה. מעבירים את החומרים המוכנים לספסל קרינה, מוסיפים ATP עם תווית אלפא-32P ל-NTP ומערבבים באמצעות פיפטינג עדין. הוסף NTP לצינורות המכילים את תערובות תגובת השעתוק במבחנה והתחל את תגובת השעתוק במבחנה על ידי הוספת תבנית DNA.
מערבבים את נפח התגובה על ידי פיפטציה עדינה ודגרים על הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בתרמוסייקלר או בלוק חום. הסר את התגובות מהתרמוסייקלר או בלוק החום ועצור את תגובות השעתוק במבחנה על ידי הוספת נפח שווה של צבע טעינת RNA פי 2 המכיל 50% פורממיד לתערובת התגובה. פירוק האנזימים על ידי דגירה על תגובות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בתרמוסייקלר או בלוק חום.
באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, יש להפריד את ה-RNA המשועתק במבחנה בג'ל פוליאקרילאמיד אוריאה של 10% עד 15%TBE במתח של 180 וולט למשך 30 עד 45 דקות. לאחר הסרת כל חלק של הג'ל המכיל ATP לא משולב, חשוף את הג'ל למסך הפוספו למשך הלילה וצלם את הרנ"א המסומן ברדיו באמצעות מצלמת פוספו. SDS-PAGE הראה שלושה פסים המתאימים לשלושה פפטידים, RpoC, RpoB ו-RpoA של קומפלקס RNA פולימראז.
כמו כן נצפה פפטיד של 115 קילודלטון התואם את גודלו של הרקומביננטי Borreliella burgdorferi RpoD המתויג MBP. פיצול תערובת החלבונים עם פרוטאז פקטור XA הוביל ליצירת שני מוצרים משמעותיים, RpoD ו- MBP. אתר היזם של Borreliella burgdorferi FLGB נוצר על ידי PCR.
דילול כפול של ריכוז RpoD מוליד רמה נמוכה יותר של תוצר הרנ"א המצטבר. ריכוז RNA פולימראז נמוך נותן פחות תוצרי RNA בטווח ריכוזי RpoD. אות הצפיפות הצביע על קשר ליניארי בין כמות RpoD הקיימת בתגובה בשני הניסויים.
הפעילות האנזימטית של RNA פולימראז רגישה למגוון גורמים במהלך תהליך הטיהור, האחסון והניסוי. אנזימים וריאגנטים טריים, יחד עם תכנון טוב, נותנים את הסיכוי הטוב ביותר להצלחה בפרוטוקול זה.
