يصف هذا البروتوكول تقنية منصة لعزل الخلايا البطانية الدقيقة من العضلات العظمية. يمكن استخدام هذه الخلايا، على سبيل المثال، للحصول على مزيد من الرؤى في وظائف حاجز عضلة الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الموجودة هي أنه من الممكن عزل الخلايا البطانية الدقيقة الأولية ذات النقاوة العالية.
هذه التقنية يمكن أن تساعد على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض العضلات التي تتوسطها المناعة مثل التفاعل بين العضلات والخلايا البطانية في الصحة والمرض. أولاً، إعداد جميع الحلول اللازمة ولوحات الستة الآبار كما هو موضح في البروتوكول. لبدء الإجراء العملي، والحصول على زوج من مقص حاد / حادة الجراحية، وزوج من مقص حاد / حاد الجراحية، والملقط مستقيم ومنحني.
تطهير جميع الأدوات الجراحية مع 70٪ الإيثانول. وضع فأر ذكر بالغ القتل الرحيم على ظهره وترطيب الساقين مع 70٪ الإيثانول. باستخدام مقص حاد / حادة الجراحية، وقطع كل ساق كاملة عن طريق قطع في مفصل الورك.
ضع الأطراف في طبق ثقافة الخلية المغلقة. نقل الطبق إلى غطاء تدفق لارينار العقيمة. استخدم مقصًا حادًا وملقطًا منحنيًا لقطع الجلد من الورك إلى طرف إصبع الظهر.
استخدام ملقط مستقيم لعقد القدم أو القدم وسادة أثناء استخدام ملقط منحني لقشر الجلد من القدم إلى الورك. لعزل العضلات رباعية الفخذ، وقطع وتر من الركبة، وقطع العضلات على طول عظم الفخذ إلى الورك. قطع وتر أخيل لعزل surae العضلة الثلاثية.
المقبل، وقطع على طول الساق إلى فوسا popliteal وإزالة العضلات. لإزالة الأوتار التي لا يمكن فصلها، عقد العضلات مع ملقط منحنية وقطع كل وتر المناسبة. إضافة 2، 445 ميكرولترات من حل الهضم المعدة إلى الطازجة، وصفت طبق ثقافة الخلية وتحديد الوزن.
نقل كل من القطع العضلية لهذا الطبق. ثم، تحديد الوزن. الفرق بين القيم المقاسة على حد سواء يوفر الوزن الجاف للأنسجة العضلية التي يجب ألا تتجاوز غرام واحد.
باستخدام مقص حاد الجراحية، وقطع الأنسجة العضلية كلها إلى قطع صغيرة. احتضان تعليق الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 1.5 ساعة، مع التأكد من خلط التعليق بعناية مع حقنة الأنسولين ملليلتر واحد كل 20 دقيقة لمدة خمس دقائق تقريبا. بعد الحضانة، نقل التعليق إلى مصفاة نايلون 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 ملليلتر المسمى وجمع تدفق من خلال.
غسل مصفاة الخلية مع ثمانية ملليلتر من DMEM وجمع من خلال تدفق. إذا كانت القطع هي سد مصفاة، resuspend الحل المنفصلة. تخلص من مصفاة الخلية والطرد المركزي التعليق في 300 مرة الجاذبية وعند 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
إزالة بعناية عظمى وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من كلوريد البوتاسيوم الأمونيوم lysing العازلة لتحلل من خلايا الدم الحمراء. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. ثم، إضافة تسعة ملليلتر من DMEM تحتوي على 10٪ FCS لوقف رد الفعل.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم، استخدم غرفة جرد خلية Neubauer لتحديد أرقام الخلايا. للبدء في استنزاف الخلايا إيجابية CD45، الطرد المركزي تعليق في 300 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
إزالة supernatant تماما وإعادة ربط بيليه الخلية في 90 ميكرولترات من العازلة MCS. إضافة 10 ميكروليتر من الميكروبات CD45 وخلط التعليق. احتضان في ثلاجة في أربع إلى ثماني درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS. جهاز طرد مركزي في 300 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من العازلة MCS.
ضع عمود مغناطيسي كبير في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف خزان العمود مع ثلاثة ملليلترات من العازلة MCS. ثم، ضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع التدفق من خلال.
تطبيق تعليق الخلية بأكملها إلى العمود والسماح لها من خلال تدفق تماما. اغسل العمود ثلاث مرات عن طريق إضافة ثلاثة ملليلترات من العازلة MCS في الخزان لكل خطوة الغسيل والانتظار حتى خزان العمود فارغة قبل البدء في الخطوة الغسيل التالية. جمع الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر عبر العمود لاستخدامها في خطوات فصل إضافية.
لبدء تراكم الخلايا إيجابية CD31، استخدم غرفة العد خلية Neubauer لتحديد أرقام الخلايا. وبعد ذلك، تعمل أجهزة الطرد المركزي على الخلايا غير المُوَجَّهة بجاذبية 300 مرة وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant تماما وإعادة فرض بيليه في 90 ميكرولترات من العازلة MCS.
إضافة 10 ميكروليتر من الميكروبات CD31 وخلط التعليق كله. احتضان في ثلاجة في أربع إلى ثماني درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد هذا، يضاف ملليلتر واحد من العازلة MCS والطرد المركزي في 300 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من العازلة MCS. ضع العمود المغناطيسي المتوسط في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف العمود مع 500 ميكروليترس من العازلة MCS.
بعد ذلك، ضع أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أسفل العمود لجمع التدفق من خلال. تطبيق تعليق الخلية بالكامل على العمود والسماح لها تدفق تماما من خلال. اغسل العمود ثلاث مرات عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من العازلة MCS في الخزان لكل خطوة الغسيل، وانتظر حتى خزان العمود فارغة قبل البدء في الخطوة الغسيل التالية.
تمثل الخلايا غير التي تم تصنيفها التي تمر بالعمود الكسر CD45 سالب، و CD31 سالب. تخزينها لمزيد من عناصر التحكم في الجودة. ثم، قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب جمع مناسبة.
Pipette ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت MCS على العمود. دفع فورا المكبس في العمود لطرد الخلايا المغناطيسي المسمى. يمثل هذا الكسر CD45 سالب، و CD31-positive، الـ يورين ECs الأساسي المخصب.
جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 350 مرة الجاذبية و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى تماما وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط الخلية البطانية. نقل الخلايا إلى بئر واحد من لوحة ثقافة ستة جيدا المغلفة التي تحتوي على ملليلتر واحد من متوسطة الخلية البطانية.
للزراعة، احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة معقمة، مع التأكد من تحديث المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما تكون الخلايا في 80 إلى 90٪ التقاء، شطف كل خلايا تحتوي على البئر مرتين مع مليلتر من برنامج تلفزيوني في خطوتين متتاليتين الغسيل. ثم، إضافة 800 ميكرولترات من محلول تريبسين EDTA إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة عقيمة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
بعد هذا، إضافة 1، 200 ميكرولترات من DMEM تحتوي على ما لا يقل عن 10٪ FCS لوقف النشاط الأنزيمي. جهاز طرد مركزي في 350 مرة الجاذبية و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، تتراكم خلايا CD31 كما وصفت سابقا لزيادة النقاء.
استخدام حقل مشرق أو مرحلة قياسية المجهر العقد مع 20٪ التكبير والعدسة 0.35 فتحة رقمية لمراقبة التقاء الخلية. في هذه الدراسة، يتم عزل الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في العضلات العظمية الأولية. بعد يوم واحد من العزلة، تشكل مراكز الـ MMECs الأولية والخلايا الأخرى المتبقية تكتلات وتلتزم بأسفل أطباق الثقافة.
من اليوم السابع فصاعدا، يمكن ملاحظة الخلايا المسطحة والممدود، ومع ذلك، تلوث الخلايا الأخرى، ومعظمهم من الخلايا الشعاعية لا يزال مرئيا. وبالتالي ، مطلوب دورة أخرى من CD31 إيجابية الاختيار عبر MCS. وبعد ذلك، تتكاثر مراكز الـMMECs الأولية إلى كثافة تبلغ حوالي 80 إلى 90٪ عند التقاءها، وعادة ما تشكل طبقة أحادية غير متداخلة من الخلايا المنحازة طولياً.
ويتوقف الانتشار عند التقاء المنتَط بسبب تثبيط الاتصال. مراقبة الجودة عن طريق تدفق القياسات يظهر قيم لكل من البقاء والنقاء تتراوح بين حوالي 70٪ لكل من الخلايا مباشرة بعد العزل. تظهر الخلايا المزروعة بعد اختيار آخر إيجابي CD31 عبر MCS قيم مرضية للنقاء وكذلك لصلاحية البقاء ، تتراوح إلى 95 ٪ لكل من.
ثم يتم التحقيق في الخلايا التي تم الحصول عليها للتعبير الجيني لـ Muscle satellite cell علامة الجينات يقترن البروتين مربع 7 وM-cadherin على مستوى مرنا بواسطة كمية PCR. كما هو متوقع، فقط CD45-سالبة، CD31-السلبية الكسر وكذلك الخلايا العضلية المورين الأولية المتباينة أعرب عن البروتين مربع 7 وM-cadherin، في حين CD45-سالبة، CD31-positive وMMECs المورين الأولية هي سلبية لهذه العلامات. بعد الخطوة الثانية CD31 MCS، يتم استخدام qPCR لتقييم التعبير عن البروتينات تقاطع ضيق في التقاء MMECs المورين الأولية.
وينظر إلى MMECs المورين الأولية للتعبير عن مستويات عالية من كلودين-5، occludin، وzonula occludens-1، في حين PMMC تظهر سوى تعبير منخفض من occludens zonula-1. ويمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات. بعد هذا البروتوكول، يمكن تنفيذ أساليب أخرى مثل إجراء عمليات اختبار الترحيل أو تجارب الإجهاد المنخفضة القص للإجابة على أسئلة إضافية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل الخلايا البطانية الدقيقة الأولية من العضلات الهيكلية بواسطة ميكانيكي وانزيمي تفكك وفرز الخلايا المغناطيسية.
