نموذج الشبكية الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة نقدم التحقيق في الآلية الشاملة والتطوير العلاجي لتدهور الشبكية المعتمد على cGMP-PKG. يحتفظ نموذج الرئيسيات غير البشري الفردي هذا بتأكيد أنسجة الشبكية والتفاعلات بين الخلايا مما يتيح محاكاة أفضل للظروف في الجسم الحي. كما أنه يقلل من استخدام الحيوانات ويقصر المدة التجريبية.
توفير نهج تجريبي للتحكم في تطور الشبكية أو تنكسها. البدء في إعداد نباتات الشبكية عن طريق غسل مقل العيون المعزولة من المكاك البرية مع 10 ملليلتر من 5 ٪ بوفيدون اليود لمدة 30 ثانية. لتجنب التلوث البكتيري ، اغمس مقل العيون في محلول 5٪ من البنسلين ستربتومايسين PBS لمدة دقيقة واحدة قبل الحضانة في 10 ملليلتر من R16 المتوسط لمدة خمس دقائق.
ثم اغمر مقل العيون في 10 ملليلتر من محلول البروتين Ace-K المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية وحضنه لمدة دقيقتين. قم بإجراء الحضانة التالية في 10 ملليلتر من واحد إلى واحد R16 بالإضافة إلى محلول مصل بقري الجنين لمدة خمس دقائق. أعط غسلا نهائيا في 10 ملليلتر من R16 الطازج.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، افصل الصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي. ثم قطع شبكية العين من أربعة جوانب مع ملاقط ومقص. بعد ذلك ، استخدم شفرة شجرة دقيقة سعة أربعة ملليلتر لقطع نبات الشبكية عند 1.5 ملم من الجانب الأنفي ، وأربعة ملليمترات من الجانب الصدغي واثنين ملليمتر من الجانبين العلوي والسفلي لرأس العصب البصري.
ثم باستخدام شفرة دقيقة لشجرة ستة ملليمترات ، قطعت الجانب المركزي من نبات الشبكية الذي يحتوي على القرص البصري والبقعة. باستخدام ماصة عريضة ، اسحب الشبكية التي تحتوي على شبكية العين والمشيمية وضعها في منتصف الحشوة مع وضع جانب مستقبلات الضوء لأعلى. اغمر شبكية العين بالكامل في ملليلتر واحد من الوسط الكامل على اللوحة أسفل الغشاء.
قم بزراعة نباتات الشبكية وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب. إعطاء العلاج المناسب لتركيز الدواء للنباتات لمدة أربعة أيام. استخدم ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل حالة علاجية واستخدم النباتات بدون الدواء كعنصر تحكم إيجابي.
للتثبيت والتقسيم بالتبريد ، عالج نباتات الشبكية بمليلتر واحد من الألدهيد البارفورم لمدة 45 دقيقة. بعد شطف قصير مع ملليلتر واحد من PBS احتضان متسلسل النباتات في 10 ٪ السكروز لمدة 10 دقائق ، 20 ٪ السكروز لمدة 20 دقيقة ، و 30 ٪ السكروز لمدة 30 دقيقة. قطع نباتات الشبكية بشكل موحد مع أربعة أرباع في المحيط وستة ملليمترات في المركز.
ثم انقل نباتات الشبكية إلى صندوق من الصفيح يبلغ حوالي 1.5 × 1.5 × 1.5 سم مع وسيط تضمين مركب درجة حرارة القطع الأمثل الذي يغطي الزرع. على الفور ، قم بتجميد أقسام الأنسجة في النيتروجين السائل ووضعها في ثلاجة 20 درجة للتخزين. بعد ذلك ، قم بقص الآجار إلى كتلة صغيرة تحتوي على عينة الأنسجة.
قسم الكتل إلى كتل 10 ميكرومتر وضع الأقسام على شرائح مجهر الالتصاق باستخدام فرشاة ناعمة. ثم جفف المقاطع لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية وقم بتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. بالنسبة لتلطيخ أحادي فوسفات الغوانوزين الدوري أو cGMP ، ارسم حلقة كارهة للماء حول أقسام الشبكية المجففة باستخدام قلم مانع للسائل وقم بتغطية العينات.
اغمر الشرائح في 200 ميكرولتر من 0.3٪ PBS و Triton-X100 أو PBST لمدة 10 دقائق متبوعا بمعالجة لمدة ساعة واحدة في 200 ميكرولتر من محلول الحجب في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن شريحة العينة طوال الليل باستخدام 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المحضر في محلول الحجب عند أربع درجات مئوية وشطفه ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. احتضان الشريحة في 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ثلاث غسلات من PBS لمدة 10 دقائق ، قم بتغطية العينات بوسط تركيب مضاد للتلاشي يحتوي على DAPI وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير. جفف الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وارسم حلقة حاجز طاردة للماء حول عينة أنسجة الشبكية باستخدام قلم مانع للسائل. بعد الحضانة مع 40 ملليلتر من PBS لمدة 15 دقيقة ، عالج الأقسام ب 42 ملليلتر من 0.05 مولي tris-buffer أو TBS عند 37 درجة مئوية.
نضح TBS ، واحتضان العينات بستة ميكرولتر من البروتيناز K لمدة خمس دقائق وغسل الشرائح ثلاث مرات مع PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. تعريض الشرائح إلى 40 ملليلتر من محلول حمض الخليك الإيثانول في شابلن. قم بتغطيتها بورقة شفافة واحتضانها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة خمس دقائق.
اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بتعريض الشرائح إلى 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول الحجب أو 1٪ BSA واحتضانها في غرفة الرطوبة لمدة ساعة واحدة. عند حوالي 130 ميكرولتر من محلول TMR الأحمر لكل شريحة وبعد ساعة واحدة ، أعط غسلتين من 200 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما.
ضع شرائح الغطاء التي تحتوي على قطرة أو قطرتين من وسط التثبيت المضاد للتلاشي مع DAPI فوق العينات واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير. بعد تلطيخ متسلسل مع النفق و cGMP المضي قدما في المجهر الضوء والتألق عن طريق ضبط معلمات الكاميرا. التقط صورا لأربعة حقول من كل قسم باستخدام البرنامج بكاميرا رقمية بتكبير 20x.
احصل على صور تمثيلية من المناطق المركزية لشبكية العين باستخدام DAPI و EGFP و TMR مع مسح z-stack وفاصل زمني قدره ميكرومتر واحد واختياري عند 1.251 ميكرومتر. في نباتات الشبكية المعالجة بتركيزات مختلفة من مثبطات PDE6 Zaprinast ، زاد عدد الخلايا الإيجابية النفقية و cGMP بقوة في الطبقة النووية الخارجية مقارنة بالمجموعة الضابطة. تشير النسبة العالية من الخلايا الإيجابية النفقية إلى أن الزيادة في نشاط cGMP قد تعزز تنكس خلايا الشبكية الناجم عن العش قبل العش ويلعب تراكم cGMP دورا في تنكس المستقبلات الضوئية.
يجب أن يتم إعداد Explant في أقرب وقت ممكن. Op الحيوانات مبعثر الخمسات وأي تراكم لأنه يحسن بقاء الخلية ويعزز حالة الألياف من سلسلة المكدس السائب. إلى أقصى حد مرئي يجب تنظيف الجسم الزجاجي بالمنشطات.
تجنب ملامسة طبقات الألياف العصبية في شبكية العين عند نقل نباتات الشبكية لمنع إصابة الخلايا الميكانيكية. يرجى ملاحظة أنه لإصدار نقل سلس لنباتات الشبكية إلى حشوات الثقافة ، يمكن نقع الحيوان الأليف مسبقا في شيء لإبقائه رطبا قبل نقل أنسجة الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنفيذ العملية برمتها في جو الستيرويد لتجنب التلوث أثناء العملية.
