El modelo retiniano de primates establecido en este estudio nos ofrece la investigación del mecanismo integral y el desarrollo terapéutico del deterioro retiniano dependiente de cGMP-PKG. Este modelo individual de primates no humanos reserva la confirmación del tejido retiniano y las interacciones intercelulares, lo que permite una mejor simulación de las condiciones in vivo. También reduce el uso de animales y acorta la duración experimental.
Proporcionar un enfoque experimental de control para investigar el desarrollo o la degeneración de la retina. Comience la preparación de los explantes retinianos lavando los globos oculares aislados de macacos de tipo salvaje con 10 mililitros de yodo 5% povidona durante 30 segundos. Para evitar la contaminación bacteriana, sumerja los globos oculares en una solución de estreptomicina PBS de penicilina al 5% durante un minuto antes de la incubación en 10 mililitros de medio R16 durante cinco minutos.
Luego sumerja los globos oculares en 10 mililitros de solución de proteína Ace-K precalentada a 37 grados centígrados e incubada durante dos minutos. Realice la siguiente incubación en 10 mililitros de uno a uno R16 más solución fetal de suero bovino durante cinco minutos. Dar un lavado final en 10 mililitros de R16 fresco.
Una vez hecho esto, separe la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo. Luego corta la retina de cuatro lados con pinzas y tijeras. A continuación, use una cuchilla fina de árbol de cuatro mililitros para cortar el explante retiniano a 1,5 milímetros del lado nasal, cuatro milímetros del lado temporal y dos milímetros de los lados superior e inferior de la cabeza del nervio óptico.
Luego, utilizando una hoja fina de árbol de seis milímetros, corte el lado central del explante retiniano que contiene el disco óptico y la mácula. Con una pipeta ancha, tire del explante de retina que contiene la retina y la coroides y colóquelo en el centro del inserto con el lado del fotorreceptor hacia arriba. Sumerge completamente la retina en un mililitro del medio completo en la placa debajo de la membrana.
Cultive los explantes de retina y colóquelos en una incubadora de 37 grados centígrados con dióxido de carbono humidificado al 5%. Administrar el tratamiento de concentración de fármaco adecuado para explantes durante cuatro días. Use al menos tres explantes por condición de tratamiento y use los explantes sin el medicamento como control positivo.
Para la fijación y criosección, trate los explantes de retina con un mililitro de aldehído paraformado durante 45 minutos. Después de un breve enjuague con un mililitro de PBS incubar en serie los explantes en sacarosa al 10% durante 10 minutos, sacarosa al 20% durante 20 minutos y sacarosa al 30% durante 30 minutos. Corta los explantes retinianos uniformemente con cuatro cuadrantes en la periferia y seis milímetros en el centro.
Luego transfiera los explantes retinianos a una caja de hojalata de aproximadamente 1.5 por 1.5 centímetros con un medio de incrustación compuesto de temperatura de corte óptima que cubra el explante. Inmediatamente, congele las secciones de tejido en nitrógeno líquido y colóquelas en un refrigerador a 20 grados para su almacenamiento. A continuación, recorte el agar en un pequeño bloque que contenga la muestra de tejido.
Divida los bloques en bloques de 10 micrómetros y coloque las secciones en portaobjetos de microscopio de adhesión con un cepillo suave. Luego seque las secciones durante 45 minutos a 40 grados centígrados y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta que las use. Para la tinción cíclica de guanosina monofosfato o cGMP, dibuje un anillo hidrófobo alrededor de las secciones retinianas secas con una pluma bloqueadora de líquidos y cubra las muestras.
Sumerja los portaobjetos en 200 microlitros de 0,3% PBS y Triton-X100 o PBST durante 10 minutos seguido de un tratamiento de una hora en 200 microlitros de solución de bloqueo a temperatura ambiente. A continuación, incubar el portaobjetos de muestra durante la noche con los 200 microlitros de anticuerpos primarios preparados en la solución de bloqueo a cuatro grados centígrados y enjuague tres veces con PBS durante 10 minutos. Incubar el portaobjetos en 200 microlitros de anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente.
Después de tres lavados de PBS durante 10 minutos, cubra las muestras con un medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI y guárdelas a cuatro grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes. Seque el portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos y dibuje un anillo de barrera repelente al agua alrededor de la muestra de tejido retiniano con una pluma bloqueadora de líquidos. Después de la incubación con 40 mililitros de PBS durante 15 minutos, trate las secciones con 42 mililitros de tampón tris molar 0.05 o TBS a 37 grados centígrados.
Aspirar el TBS, incubar las muestras con seis microlitros de proteinasa K durante cinco minutos y lavar los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno. Exponga los portaobjetos a 40 mililitros de solución de ácido acético etanol en el chaplin. Cúbralo con una hoja transparente e incube a menos 20 grados centígrados durante cinco minutos.
Lave las diapositivas tres veces con TBS durante cinco minutos cada vez. Exponga los portaobjetos a 200 a 300 microlitros de solución de bloqueo o BSA al 1% e incubarlos en una cámara de humedad durante una hora. A aproximadamente 130 microlitros de solución roja TMR por portaobjetos y después de una hora, dé dos lavados de 200 microlitros de PBS durante cinco minutos cada uno.
Coloque portaobjetos que contengan una o dos gotas de medio de montaje antidecoloración con DAPI sobre las muestras e incube los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante al menos 30 minutos antes de obtener imágenes. Después de la tinción secuencial con túnel y cGMP, proceda a la microscopía de luz y fluorescencia ajustando los parámetros de la cámara. Capture las imágenes de cuatro campos de cada sección utilizando el software con una cámara digital con un aumento de 20x.
Obtenga imágenes representativas de las áreas centrales de la retina utilizando DAPI, EGFP y TMR con escaneo z-stack y un intervalo de un micrómetro y opcional a 1.251 micrómetros. En los explantes retinianos tratados con diferentes concentraciones de los inhibidores de la PDE6 Zaprinast el número de células positivas para túnel y GMPc aumentó considerablemente en la capa nuclear externa en comparación con el grupo control. La alta proporción de células positivas para túnel sugirió que el aumento en la actividad de cGMP puede mejorar la degeneración de células retinianas inducida por el nido y la acumulación de cGMP juega un papel en la degeneración de los fotorreceptores.
La preparación del explante debe llevarse a cabo lo antes posible. Op animal dispersa cinco y cualquier acumulación porque mejora la supervivencia celular y mejora el estado de la fibra de la serie de pilas a granel. En la mayor medida visible, el vítreo debe limpiarse con esteroides.
Evite entrar en contacto con las capas de fibras nerviosas de la retina al transferir explantes de retina para evitar lesiones celulares mecánicas. Tenga en cuenta que para emitir una transferencia suave de explantes de retina a los insertos de cultivo, la mascota puede empaparse previamente en algo para mantenerla húmeda antes de transferir los tejidos de la retina. Además, todo el proceso debe llevarse a cabo en la atmósfera de esteroides para evitar la contaminación durante el proceso.
