本研究で確立した霊長類網膜モデルを用いて、cGMP-PKG依存性網膜劣化の包括的なメカニズムの解明と治療法開発を提供します。この個々の非ヒト霊長類モデルは、網膜組織の確認と細胞間相互作用を予約し、in vivo状態のより良いシミュレーションを可能にします。また、動物の使用を減らし、実験期間を短縮します。
網膜の発達または変性を調査するための制御実験的アプローチを提供する。野生型マカクから単離された眼球を10ミリリットルの5%ポビドンヨードで30秒間洗浄することにより、網膜外植片の調製を開始する。細菌汚染を避けるために、眼球を5%ペニシリンストレプトマイシンPBS溶液に1分間浸してから、10ミリリットルのR16培地で5分間インキュベートします。
次に、37°Cで予熱した10ミリリットルのタンパク質Ace-K溶液に眼球を浸し、2分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの1対1のR16プラスウシ胎児血清溶液中で5分間インキュベーションを行う。10ミリリットルの新鮮なR16で最終洗浄を行います。
完了したら、強膜、角膜、虹彩、水晶体、硝子体を分離します。次に、ピンセットとはさみで網膜を4つの側面から切ります。次に、4ミリリットルの木の細かい刃を使って、視神経乳頭の鼻側から1.5ミリメートル、側頭側から4ミリメートル、上側と下側から2ミリメートルで網膜外植片を切断します。
次いで、6ミリメートルの木の微細な刃を用いて、視神経乳頭及び黄斑を含む網膜外植片の中央側を切り出した。幅広のピペットを使用して、網膜と脈絡膜を含む網膜外植片を引っ張り、感光体側を上にしてインサートの中央に置きます。膜の下のプレート上の1ミリリットルの完全な培地に網膜を完全に沈めます。
網膜外植片を培養し、加湿した37%二酸化炭素を含む摂氏5度のインキュベーターに入れます。外植片に適切な薬物濃度処理を4日間施す。処理条件ごとに少なくとも3つの外植片を使用し、薬物を含まない外植片をポジティブコントロールとして使用します。
固定および凍結切片の場合は、網膜外植片を1ミリリットルのパラフォームアルデヒドで45分間処理します。1ミリリットルのPBSで短時間すすぎた後、外植片を10%スクロースで10分間、20%スクロースで20分間、30%スクロースで30分間連続的にインキュベートします。網膜外植片を周囲に4つの象限、中央に6ミリメートルで均一に切断します。
次に、網膜外植片を、外植片を覆う最適な切断温度の複合包埋媒体を使用して、約1.5 x 1.5 x 1.5センチメートルのブリキの箱に移します。直ちに、組織切片を液体窒素で凍結し、20度の冷蔵庫に入れて保管します。次に、寒天を組織サンプルを含む小さなブロックにトリミングします。
ブロックを10マイクロメートルのブロックに分割し、柔らかいブラシを使用して接着顕微鏡スライドにセクションを置きます。次に、切片を摂氏40度で45分間乾燥させ、使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。環状グアノシン一リン酸またはcGMP染色の場合は、液体ブロッカーペンで乾燥した網膜切片の周りに疎水性リングを描き、サンプルを覆います。
スライドを200マイクロリットルの0.3%PBSとTriton-X100またはPBSTに10分間浸した後、室温で200マイクロリットルのブロッキング溶液に1時間処理します。次に、ブロッキング溶液で調製した200マイクロリットルの一次抗体を摂氏4度で一晩サンプルスライドをインキュベートし、PBSで10分間3回すすぎます。スライドを200マイクロリットルの二次抗体中で室温で1時間インキュベートします。
PBSを10分間3回洗浄した後、DAPIを含む退色防止封入剤でサンプルを覆い、イメージング前に摂氏4度で少なくとも30分間保存します。スライドを室温で15分間乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜組織標本の周りに撥水性バリアリングを引きます。40ミリリットルのPBSと15分間インキュベートした後、切片を42ミリリットルの0.05モルトリスバッファーまたはTBSで摂氏37度で処理します。
TBSを吸引し、サンプルを6マイクロリットルのプロテイナーゼKで5分間インキュベートし、スライドをPBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。スライドをチャップリン中の40ミリリットルのエタノール酢酸溶液にさらします。透明なシートで覆い、マイナス20°Cで5分間インキュベートします。
毎回5分間、TBSでスライドを3回洗います。スライドを200〜300マイクロリットルのブロッキング溶液または1%BSAにさらし、湿度チャンバー内で1時間インキュベートします。スライドあたり約130マイクロリットルのTMR赤色溶液で、1時間後に、200マイクロリットルのPBSをそれぞれ5分間2回洗浄します。
DAPIを含む1〜2滴の退色防止封入剤を含むカバースライドをサンプルの上に置き、イメージングの前にスライドを摂氏4度で少なくとも30分間インキュベートします。トンネルとcGMPで連続染色した後、カメラのパラメータを調整して光学顕微鏡と蛍光顕微鏡に進みます。各セクションの4つのフィールドの画像を、20倍の倍率でデジタルカメラを備えたソフトウェアを使用してキャプチャします。
DAPI、EGFP、TMRを使用して網膜の中央領域から代表的な画像を取得し、zスタックスキャンと1マイクロメートルの間隔を1マイクロメートル、オプションで1.251マイクロメートルにします。異なる濃度のPDE6阻害剤Zaprinastで処理した網膜外植片では、対照群と比較して、トンネルおよびcGMP陽性細胞数が外顆粒層で強く増加した。トンネル陽性細胞の割合が高いことは、cGMP活性の増加が巣前誘導網膜細胞変性を増強し、cGMP蓄積が光受容体変性に役割を果たす可能性があることを示唆した。
外植片の準備はできるだけ早く行わなければなりません。Op動物は、細胞の生存を改善し、バルクスタックシリーズの繊維の状態を高めるため、5つおよび任意の蓄積を散布します。目に見える最大限に、硝子体はステロイドできれいにされるべきです。
機械的細胞損傷を防ぐために、網膜外植片を移植するときは網膜神経線維層との接触を避けてください。網膜外植片を培養インサートにスムーズに移すために、網膜組織を移す前にペットを何かにあらかじめ浸して湿らせておくことができます。さらに、プロセス中の汚染を避けるために、プロセス全体をステロイド雰囲気で実行する必要があります。
