Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı retina bozulmasının kapsamlı mekanizmasını ve terapötik gelişimini araştırdı. Bu bireysel insan dışı primat modeli, retinal doku doğrulamasını ve in vivo koşulların daha iyi simülasyonunu sağlayan hücreler arası etkileşimleri saklı tutar. Ayrıca hayvan kullanımını azaltır ve deney süresini kısaltır.
Retina gelişimi veya dejenerasyonunu araştırmak için kontrol deneysel bir yaklaşım sağlamak. Yabani tip makaklardan izole edilen göz kürelerini 10 mililitre% 5 povidon iyot ile 30 saniye boyunca yıkayarak retinal eksplantların hazırlanmasına başlayın. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için, göz kürelerini beş dakika boyunca 10 mililitre R16 ortamında inkübasyondan önce bir dakika boyunca% 5'lik bir penisilin streptomisin PBS çözeltisine batırın.
Daha sonra göz kürelerini, 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış ve iki dakika boyunca inkübe edilmiş 10 mililitre protein Ace-K çözeltisine batırın. Bir sonraki inkübasyonu beş dakika boyunca 10 mililitre bir ila bir R16 artı fetal sığır serum çözeltisinde gerçekleştirin. 10 mililitre taze R16'da son bir yıkama yapın.
İşiniz bittiğinde, sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesini ayırın. Sonra retinayı dört taraftan cımbız ve makasla kesin. Daha sonra, retinal eksplantı burun tarafından 1,5 milimetre, temporal taraftan dört milimetre ve optik sinir başının üst ve alt taraflarından iki milimetre kesmek için dört mililitrelik bir ağaç ince bıçağı kullanın.
Daha sonra altı milimetrelik bir ağaç ince bıçağı kullanarak, optik disk ve makulayı içeren retinal eksplantın orta tarafını kesin. Geniş bir pipet kullanarak, retina ve koroidi içeren retina eksplantını çekin ve fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde ekin ortasına yerleştirin. Retinayı, zarın altındaki plakadaki tam ortamın bir mililitresine tamamen batırın.
Retinal eksplantları kültüre alın ve nemlendirilmiş% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Dört gün boyunca eksplantlara uygun ilaç konsantrasyonu tedavisini verin. Tedavi koşulu başına en az üç eksplant kullanın ve eksplantları ilaçsız pozitif bir kontrol olarak kullanın.
Sabitleme ve kriyo-kesit için, retinal eksplantları 45 dakika boyunca bir mililitre paraform aldehit ile tedavi edin. Bir mililitre PBS ile kısa bir durulamadan sonra, eksplantları seri olarak 10 dakika boyunca% 10 sakaroz, 20 dakika boyunca% 20 sakkaroz ve% 30 sakkaroz içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Retinal eksplantları çevrede dört kadran ve merkezde altı milimetre olacak şekilde düzgün bir şekilde kesin.
Daha sonra retinal eksplantları, eksplantı kaplayan optimum bir kesme sıcaklığı bileşiği gömme ortamı ile yaklaşık 1.5 x 1.5 x 1.5 santimetrelik bir teneke kutuya aktarın. Hemen, doku bölümlerini sıvı azotla dondurun ve saklamak için 20 derecelik bir buzdolabına koyun. Ardından, agar'ı doku örneğini içeren küçük bir bloğa kesin.
Blokları 10 mikrometrelik bloklara bölün ve bölümleri yumuşak bir fırça kullanarak yapışma mikroskobu slaytlarına yerleştirin. Daha sonra bölümleri 40 santigrat derecede 45 dakika kurutun ve kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Siklik guanozin monofosfat veya cGMP boyama için, kurutulmuş retina bölümlerinin etrafına sıvı bloker kalemle hidrofobik bir halka çizin ve numuneleri örtün.
Slaytları 10 dakika boyunca 200 mikrolitre% 0.3 PBS ve Triton-X100 veya PBST'ye daldırın, ardından oda sıcaklığında 200 mikrolitre bloke edici çözeltiye bir saatlik bir işlem uygulayın. Daha sonra, numune slaydını, bloke edici çözeltide dört santigrat derecede hazırlanan 200 mikrolitre birincil antikor ile gece boyunca inkübe edin ve 10 dakika boyunca PBS ile üç kez durulayın. Slaydı oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre ikincil antikor içinde inkübe edin.
PBS'nin 10 dakika boyunca üç kez yıkanmasından sonra, numuneleri DAPI içeren bir antifade montaj ortamı ile örtün ve görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede saklayın. Slaytı oda sıcaklığında 15 dakika kurutun ve retina dokusu örneğinin etrafına sıvı bloker kalemle su itici bir bariyer halkası çizin. 15 dakika boyunca 40 mililitre PBS ile inkübasyondan sonra, bölümleri 37 santigrat derecede 42 mililitre 0.05 molar tris tampon veya TBS ile tedavi edin.
TBS'yi aspire edin, numuneleri beş dakika boyunca altı mikrolitre proteinaz K ile inkübe edin ve slaytları her biri beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Slaytları chaplin içinde 40 mililitre etanol asetik asit çözeltisine maruz bırakın. Şeffaf bir tabaka ile örtün ve beş dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin.
Slaytları her seferinde beş dakika boyunca TBS ile üç kez yıkayın. Slaytları 200 ila 300 mikrolitre bloke edici çözeltiye veya% 1 BSA'ya maruz bırakın ve bir saat boyunca bir nem odasında inkübe edin. Slayt başına yaklaşık 130 mikrolitre TMR kırmızı çözeltisinde ve bir saat sonra, her biri beş dakika boyunca 200 mikrolitre PBS'lik iki yıkama yapın.
Bir ila iki damla antifade montaj ortamı içeren kapak slaytlarını DAPI ile numunelerin üzerine yerleştirin ve slaytları görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Tünel ve cGMP ile sıralı boyamadan sonra kamera parametrelerini ayarlayarak ışık ve floresan mikroskobu için ilerleyin. Yazılımı kullanarak her bölümden dört alanın görüntülerini 20x büyütmede bir dijital kamera ile yakalayın.
DAPI, EGFP ve TMR kullanarak retinanın merkezi bölgelerinden z-stack tarama ve bir mikrometre aralıklarla ve isteğe bağlı olarak 1.251 mikrometrede temsili resimler elde edin. PDE6 inhibitörleri Zaprinast'ın farklı konsantrasyonları ile tedavi edilen retinal eksplantlarda, dış nükleer tabakada tünel ve cGMP pozitif hücrelerin sayısı kontrol grubuna kıyasla güçlü bir şekilde artmıştır. Tünel pozitif hücrelerin yüksek oranı, cGMP aktivitesindeki artışın pre nest kaynaklı retinal hücre dejenerasyonunu artırabileceğini ve cGMP birikiminin fotoreseptör dejenerasyonunda rol oynadığını düşündürmektedir.
Eksplant hazırlığı mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. Op hayvan saçılım beşli ve herhangi bir birikim çünkü hücre hayatta kalmasını iyileştirir ve dökme yığın serisinin lif durumunu arttırır. Görülebilir ölçüde vitreus steroidlerle temizlenmelidir.
Mekanik hücre hasarını önlemek için retina eksplantlarını transfer ederken retinal sinir lifi katmanlarına temas etmekten kaçının. Lütfen retinal eksplantların kültür eklerine düzgün bir şekilde aktarılmasını sağlamak için, evcil hayvanın retina dokularını aktarmadan önce nemli tutmak için bir şeye önceden batırılabileceğini unutmayın. Ek olarak, işlem sırasında kontaminasyonu önlemek için tüm işlem steroid atmosferinde gerçekleştirilmelidir.
